一种测定去氧胆酸或去氧胆酸中间体中叔丁基过氧化氢含量的方法与流程

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种测定去氧胆酸或去氧胆酸中间体中潜在基因毒性杂质叔丁基过氧化氢(tbhp)含量的方法。

背景技术：

1、去氧胆酸(deoxycholic acid)，化学名为3α,12α-二羟基-5β-胆烷酸，结构式如下式(i)所示，是一种可注射的细胞溶解药物。去氧胆酸注射液最先由美国凯瑟拉生物制药公司研发，于2015年4月由美国食品药物监察管理局(fda)批准上市，商品名belkyra，是首个获得fda批准用于治疗下巴脂肪堆积的溶脂针。

2、

3、去氧胆酸广泛存在于动物体内，动物来源的去氧胆酸成本较低，然而动物源的脱氧胆酸可能含有病原体，因此急需植物来源或化学合成方法获得的去氧胆酸。

4、cn106146593b公开了一种制备去氧胆酸的方法，反应路线如下：

5、

6、

7、然而，在生产过程中发现，合成中间体4的步骤中使用的氧化剂tbhp可能会残留在中间体4或原料药去氧胆酸中。tbhp含有-o-o-基团，为潜在的基因毒性警示结构。为了更好地控制产品质量，并验证杂质的毒性，本技术人委托第三方对包含tbhp在内的31种工艺和降解杂质进行了分析评估。具体地，根据国际人用药品注册技术要求协调会指导原则(ichm7)，通过两种互补的(q)sar预测方法(一种是基于专家知识规则的，另一种是基于统计学的)进行杂质的毒性评估，评估采用lhasa limited公司的derek nexus&sarah nexus评估软件进行。该方法是一种使用计算方法分析、模拟、可视化或预测化学品毒性的毒性评估方法，在时间、成本和动物福利方面具有明显优势，可用于预测细菌致突变试验的结果，已经被fda、ema和cde等普遍接受。如果细菌致突变(ames)试验为阳性，则需要对该杂质采取控制措施，或者如果该杂质水平不能控制在一个适当的可接受限度，则建议进行体内基因突变试验，以进行进一步的危害评估。评估结果显示，两种互补的预测方法及ames试验均显示杂质tbhp的致突变性为阳性，为致突变杂质(图1)。致突变杂质是指在较低水平时也有可能直接引起dna损伤，导致dna突变，从而可能引发癌症的遗传毒性杂质。因此，在去氧胆酸生产过程中，检测去氧胆酸中间体和原料药中tbhp的含量，严格控制tbhp的残留量使其处于适当的可接受范围，对药品的质量控制和安全性至关重要。

8、临床中，去氧胆酸注射液(10mg/ml)为间歇给药，每月给药1次，每次最大给药体积10ml(100mg)，给药总时间跨度最长约为6个月(即给药6天，小于1月)，则该药物中单个杂质的可接受摄入量为120μg/天。经计算，去氧胆酸中的tbhp杂质限度为1200ppm。

9、已有多篇文献报道了检测tbhp含量的方法。例如，文献1(石墨烯修饰电极检测有机过氧化物的研究，《武汉纺织大学学报》，2013，第26卷，第6期，第23-26页)公开了电化学方法测定有机过氧化物tbhp含量；文献2(journal of analytical chemistry,2016,71(9),932–943)公开了在过氧化物酶催化下，使用分光光度计生物传感器测定在胶束和水溶液中有机过氧化物tbhp的含量；文献3(org.process res.dev.2019,23,2538-2542)研究了使用浸渍试纸半定量试纸测定有机溶剂中tbhp含量的适用性；过氧化物存在重大安全风险，文献4(org.process res.dev.2020,24,1321-1327)公开了一种基于液相色谱-紫外的方法检测有机氢过氧化物的方法。上述方法或步骤繁琐、试验条件苛刻，或tbhp检测灵敏度低和重复性差，很难在常规药物分析实验室实施。因此开发一种适用于药物分析试验的高灵敏度的tbhp含量分析方法对于药品的质量控制具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述问题，提供一种基于柱前衍生化高效液相色谱法测定叔丁基过氧化氢(tbhp)含量的方法。该方法由tbhp与三苯基膦(tpp)发生衍生化反应，生成三苯基氧膦(tppo)，通过测定tppo的量实现对tbhp的检测，可用于测定低水平的tbhp含量(例如ppm级别)，具有成本低、操作简便、准确度高、灵敏度好的优点，非常适合用于测定去氧胆酸或去氧胆酸中间体中致突变杂质tbhp的含量。

2、为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

3、一种测定去氧胆酸或去氧胆酸中间体中潜在基因毒性杂质叔丁基过氧化氢(tbhp)含量的方法，其特征在于，该方法采用柱前衍生化高效液相色谱法进行检测，柱前衍生化采用三苯基膦对样品进行衍生化处理；高效液相色谱的检测条件为：

4、色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；优选为agilent eclipse plus c18柱或waters symmetry c18柱；更优选地，所述色谱柱的规格为4.6×100mm,3.5μm；

5、流动相a：0.01～0.10％磷酸水溶液；优选为0.04～0.06％磷酸水溶液；更优选为0.05％磷酸水溶液；

6、流动相b：乙腈；

7、流速：0.9～1.1ml/min；优选为1.0ml/min；

8、检测波长：210～250nm；优选为223～227nm；更优选为225nm；

9、进样体积：5～10μl；

10、柱温：30～40℃；优选为35℃；

11、梯度洗脱程序为：

12、

13、

14、优选地，梯度洗脱程序为：

15、

16、更优选地，梯度洗脱程序为：

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18、本发明方法通过柱前衍生化对待测样品(例如去氧胆酸、去氧胆酸中间体)进行前处理，然后通过高效液相色谱法测定tbhp的含量。具体地，采用衍生化试剂三苯基膦(tpp)对样品进行衍生化处理，使tpp与待测品中的tbhp发生衍生化反应，生成三苯基氧膦(tppo)；通过高效液相色谱法测定对tppo的含量，从而计算得出待测样品中tbhp的含量。衍生化反应机理如下：

19、

20、在一种实施方式中，稀释剂/空白溶剂为甲醇或乙腈，进一步地，稀释剂/空白溶剂可根据待测样品的溶解度进行选择。例如，当样品为去氧胆酸时，稀释剂为甲醇；当样品为去氧胆酸中间体时，稀释剂为乙腈。

21、在一种实施方式中，衍生化处理的温度为25～40℃。

22、在一种实施方式中，样品为去氧胆酸，稀释剂为甲醇，衍生化处理包括将样品与三苯基膦在甲醇中发生衍生化反应，反应时间为1.5～2.5小时，优选2小时；或者，样品为去氧胆酸中间体，稀释剂为乙腈，衍生化处理包括将样品与三苯基膦在乙腈中发生衍生化反应，反应时间为13～17小时，优选15小时。

23、在一种实施方式中，所述方法包括使用三苯基氧膦对照品溶液。具体地，将三苯基氧膦对照品溶于稀释剂中，配制成浓度1～5μg/ml的三苯基氧膦对照品溶液；优选地，三苯基氧膦对照品溶液的浓度为3μg/ml。

24、在一种实施方式中，所述方法包括使用供试品溶液。具体地，将供试品与三苯基膦溶于稀释剂中，得到供试品浓度为5mg/ml，三苯基膦浓度为0.1mg/ml的溶液；该溶液的供试品中存在的tbhp与tpp在25℃～40℃发生衍生化反应，得到衍生化处理的供试品溶液；优选地，衍生化反应温度为40℃。

25、在一种实施方式中，衍生化反应的时间与溶剂有关。当稀释剂为甲醇时，衍生化反应的时间为1.5～2.5小时，优选为2小时；当稀释剂为乙腈时，衍生化反应的时间为13～17小时，优选15小时。

26、在一种实施方式中，所述方法包括使用空白衍生化试剂。具体地，将三苯基膦溶于稀释剂中，得到0.1mg/ml的三苯基膦溶液，然后在25～40℃放置与衍生化反应相同的时间，得到空白衍生化试剂。使用空白衍生化试剂可以证明空白衍生化试剂中tppo本底较小，不干扰样品的检测；还可以证明经水浴处理后，tppo本底与0时相比基本不变，即空白衍生化试剂在该温度下保持稳定。空白衍生化试剂可以消除空白衍生化试剂中tppo本底对检测结果的影响，校正实验结果，提高检测结果的准确度。

27、在一种实施方式中，去氧胆酸或去氧胆酸中间体中的tbhp的含量通过以下公式计算：

28、

29、其中：

30、aspl为供试品溶液中tppo峰面积(扣除空白校正后)；

31、astd为tppo对照品溶液中tppo峰面积；

32、pstd为tppo对照品纯度，％；

33、mstd为tppo对照品称样量，mg；

34、mspl为样品称样量，mg；

35、sstd为tppo对照品稀释倍数；

36、sspl为样品稀释倍数；

37、mtbhp为tbhp的相对分子质量，约为90.12；

38、mtppo为tppo的相对分子质量，约为278.28；

39、mtbhp与mtppo的比值为换算系数。

40、在一种示范性实施例中，本发明提供一种测定去氧胆酸或去氧胆酸中间体中tbhp含量的方法，其特征在于，该方法采用柱前衍生化高效液相色谱法进行检测，检测条件为：

41、色谱柱：agilent eclipse plus c18柱或waters symmetry c18柱，规格4.6×100mm,3.5μm；

42、流动相a：0.04～0.06％磷酸水溶液；

43、流动相b：乙腈；

44、流速：0.9～1.1ml/min；

45、检测波长：223～227nm；

46、进样体积：5μl；

47、柱温：30～40℃；

48、梯度洗脱程序为：

49、

50、在另一种示范性实施例中，本发明提供一种测定去氧胆酸或去氧胆酸中间体中tbhp含量的方法，其特征在于，该方法采用柱前衍生化高效液相色谱法进行检测，检测条件为：

51、色谱柱：agilent eclipse plus c18柱或waters symmetry c18柱，规格为4.6×100mm,3.5μm；

52、流动相a：0.05％磷酸水溶液；

53、流动相b：乙腈；

54、流速：1.0ml/min；

55、检测波长：225nm；

56、进样体积：5μl；

57、柱温：35℃；

58、稀释剂：甲醇或乙腈；

59、梯度洗脱程序为：

60、

61、在另一种示范性实施例中，本发明的方法包括如下的溶液配制：

62、稀释剂/空白溶剂为甲醇或乙腈；当待测品为去氧胆酸时，稀释剂为甲醇；当待测品为去氧胆酸中间体时，稀释剂为乙腈；

63、三苯基氧膦对照品溶液的配制：将三苯基氧膦对照品溶于稀释剂中，配制成浓度为3μg/ml的三苯基氧膦对照品溶液；

64、供试品溶液的配制：将供试品与三苯基膦溶于稀释剂中，其中供试品浓度为5mg/ml，三苯基膦的浓度为0.1mg/ml；供试品与三苯基膦在40℃发生衍生化反应，冷却至室温，得到供试品溶液；其中当稀释剂为甲醇时，衍生化反应的时间为2小时；当稀释剂为乙腈时，衍生化反应的时间为15小时；

65、空白衍生化试剂的配制：将三苯基膦溶于稀释剂中，配制成浓度为0.1mg/ml的溶液，该溶液在40℃放置与衍生化反应相同的时间，冷却至室温，得到空白衍生化试剂。

66、在另一种示范性实施例中，本发明的方法包括样品检测和含量计算。具体地，分别将空白衍生化试剂、三苯基氧膦对照品溶液、供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；并按以下公式计算tbhp的含量：

67、

68、其中：

69、aspl为供试品溶液中tppo峰面积(扣除空白校正后)；

70、astd为tppo对照品溶液中tppo峰面积；

71、pstd为tppo对照品纯度，％；

72、mstd为tppo对照品称样量，mg；

73、mspl为样品称样量，mg；

74、sstd为tppo对照品稀释倍数；

75、sspl为样品稀释倍数；

76、mtbhp为tbhp的相对分子质量，约为90.12；

77、mtppo为tppo的相对分子质量，约为278.28。

78、本发明采用柱前衍生化高效液相色谱法检测具有潜在基因毒性的致突变杂质tbhp的含量，该方法具有操作简单、准确度高、灵敏度高、耐用性好等优点。本发明的方法可用于测定任意可能含有tbhp的样品，尤其适用于检测含有微量tbhp的药品，具体地可以用于测定去氧胆酸、或者去氧胆酸制备工艺中的中间体(例如中间体4)。通过对原料药去氧胆酸或其中间体(例如中间体4)的tbhp的量进行检测和控制，可实现对去氧胆酸的质量控制，保障用药安全性。