MBs-ssDNA-hCG探针、试剂盒及其在检测IAP中的应用

本发明属于碱性磷酸酶(iap)检测，具体涉及mbs-ssdna-hcg探针、试剂盒及其在检测iap中的应用。

背景技术：

1、炎症性肠病(ibd)是一种以胃肠道炎症性紊乱为特征的免疫介导的慢性疾病，随着生活水平的提高和饮食结构的改变，ibd的发病率逐年升高。目前的研究认为ibd主要与遗传、微生物、免疫、环境等因素有关。ibd的临床诊断是基于临床指标(症状和实验室检查)，内窥镜检查，活检和非侵入性成像技术，如计算机断层扫描(ct)和磁共振成像(mri)的综合评估。内镜检查被认为是ibd的金标准诊断方法，但其具有侵入性，且检查会引起明显的不适，限制了其在ibd早期筛查中的可接受性。因此，建立一种简单、无创、可靠的ibd辅助诊断方法，对于ibd的早期筛查十分必要。近年来，分子标志物如血清学、组织学和粪便标志物等逐渐应用于ibd的早期诊断。其中粪便样本采集方便，普遍为患者所接受，大大降低了可能对患者造成的身体或心理的创伤。同时粪便样本与肠道直接接触，因此粪便生物标志物对于肠道炎症有更高的特异性。近年来，人们探索了几种粪便标志物在ibd诊断和监测中的作用，如基质金属蛋白酶9(mmp 9)、钙卫蛋白、乳铁蛋白、脂质运载蛋白2、碱性磷酸酶等。肠道碱性磷酸酶(iap)是金属酶超家族的一员，可催化水解去除核酸、蛋白质等多种生物分子中的磷酸盐。iap主要由肠细胞分泌，在肠腔和血流中表达，被认为是维持肠道稳态的重要粘膜因子。多项研究表明，ibd炎症黏膜内的iap浓度明显低于健康人。目前，已经报道了多种方法来监测iap活性，如比色法、荧光法、电化学法和表面增强拉曼光谱法(sers)。然而，这些方法都需要特定的设备和专业的操作。

2、目前市场上已有多种即时检测(poc)设备被用于检测生物标志物，如侧流免疫测定(lfa)、温度计、个人尿酸计和个人血糖计(pgm)。其中，lfa作为一种成熟的检测技术，具有稳定、可靠、安全、简便等优点。但是大多数传统的试纸都是基于双抗体夹心原理，双抗体的使用无疑增加了试纸开发的成本和难度。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种mbs-ssdna-hcg探针、试剂盒及其在检测iap中的应用。

2、本发明的第一方面，提供一种mbs-ssdna-hcg探针，所述探针由序列如seq idno.1所示的ssdna将人绒毛膜促性腺激素结合到链霉亲和素修饰的磁珠表面构成。

3、进一步的，所述ssdna的3′端标记生物素，5′端修饰有羧基。

4、本发明的第二方面，提供所述mbs-ssdna-hcg探针的制备方法，包括以以下步骤：

5、1)将所述链霉亲和素修饰的磁珠与ssdna于buffer 1中反应1-1.5h，反应完成后除去过量的ssdna，得到mbs-ssdna；

6、2)将所述mbs-ssdna分散于mes buffer中，依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液和n-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(sulfo-nhs)溶液，混匀后反应20-25min，用pbs buffer洗涤后分散于pbs buffer中，加入人绒毛膜促性腺激素(hcg)溶液，过夜反应，之后去除未连接的hcg分子，得到mbs-ssdna-hcg探针；

7、进一步的，步骤1)-2)中反应温度均为室温。

8、更进一步的，所述buffer 1的组成为100mm tris，1m nacl，hcl调ph至7.5；所述mes buffer的组成为0.1m mes，0.5m nacl，ph至6.0；所述pbs buffer的组成为0.1mna2hpo4·12h2o与nah2po4·2h2o，0.1m nacl，ph7.2。

9、本发明的第三方面，提供一种检测生物传感器，包括cas12a-crrna复合物、dsdna以及所述的mbs-ssdna-hcg探针；

10、所述cas12a-crrna复合物由cas12a和crrna孵育结合得到，所述crrna的序列如seq id no.2所示；

11、所述dsdna由seq id no.3所示的核酸序列与其反向互补的核酸序列组成，seq idno.3所示的核酸序列5′端磷酸化修饰。

12、本发明的第四方面，提供一种试剂盒，包括妊娠试纸条和所述的检测生物传感器。

13、本发明的第五方面，提供述试剂盒在非诊断目的的检测碱性磷酸酶中的应用。

14、本发明具有以下有益效果：

15、本发明提出了一种靶标诱导dsdna探针去磷酸化，以触发cas12a的反式切割活性来检测iap的方法。如图1所示，首先通过一段单链dna(ssdna)将人绒毛膜促性腺激素(hcg)偶联到链霉亲和素包覆的磁珠(mbs)上，构建了mbs-ssdna-hcg探针，其中ssdna 3′端标记生物素，5′端修饰有羧基(cooh)。同时设计了一条dsdna探针作为iap的识别底物和crispr-cas12a的激活剂，其中dsdna的一条链在5′端进行磷酸化修饰。当靶标iap存在时，iap催化dsdna探针去磷酸化，从而保护dsdna免受体系中核酸外切酶(λexo)的切割，保留的完整dsdna与crispr-cas12a/crrna结合，从而激活cas12a酶的反式切割能力。最终，激活的cas12a开始切割hcg和mbs之间的ssdna，将hcg分子释放到溶液中。磁吸附后，上清液中的hcg能够在妊娠试纸条上显色。在没有iap的情况下，dsdna中5′-磷酸化的单链dna被λexo切割。被切割降解的dsdna无法激活cas12a的活性，因此无法切割mbs-ssdna-hcg探针，试纸条测试线不显示任何颜色。因此，iap的定量可以根据妊娠试纸的颜色深度来实现。

技术特征：

1.一种mbs-ssdna-hcg探针，其特征在于，所述探针由序列如seq id no.1所示的ssdna将人绒毛膜促性腺激素结合到链霉亲和素修饰的磁珠表面构成。

2.根据权利要求1所述的mbs-ssdna-hcg探针，其特征在于，所述ssdna的3′端标记生物素，5′端修饰有羧基。

3.权利要求1所述mbs-ssdna-hcg探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)-2)中反应温度均为室温。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述buffer 1的组成为100mm tris，1m nacl，ph 7.5；所述mes buffer的组成为0.1m mes，0.5mnacl，ph 6.0；所述pbs buffer的组成为0.1m na2hpo4·12h2o与nah2po4·2h2o，0.1m nacl，ph 7.2。

6.一种检测生物传感器，其特征在于，包括cas12a-crrna复合物、dsdna以及权利要求1所述的mbs-ssdna-hcg探针；

7.一种试剂盒，其特征在于，包括妊娠试纸条和权利要求6所述的检测生物传感器。

8.权利要求7所述试剂盒在非诊断目的的检测碱性磷酸酶中的应用。

技术总结
本发明属于碱性磷酸酶检测技术领域，具体涉及MBs‑ssDNA‑hCG探针、试剂盒及其在检测IAP中的应用。所述探针由序列如SEQ ID NO.1所示的ssDNA将人绒毛膜促性腺激素结合到链霉亲和素修饰的磁珠表面构成。本发明还提供了一种检测生物传感器，包括所述MBs‑ssDNA‑hCG探针、Cas12a‑crRNA复合物和dsDNA，本发明还提供了一种试剂盒，包括妊娠试纸和所述的生物传感器。利用所述试剂盒检测碱性磷酸酶(IAP)的方法具有良好的分析选择性，可用于检测炎症性肠病(IBD)患者粪便样本中IAP的水平。

技术研发人员：张明真,贾真真,张明鑫
受保护的技术使用者：西安交通大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16