一种基于代谢组学结合网络药理学分析龟背、腹甲抗癌活性差异的方法

本发明涉及一种基于代谢组学结合网络药理学分析龟背、腹甲抗癌活性差异的方法，属于代谢组学。

背景技术：

1、龟甲是一种具有良好生物活性的食药两用型水生副产物，为龟科动物的背甲和腹甲，营养成分丰富，始载于《神农本草经》，当时认为只有腹甲才具有营养药用价值，因此很长一段时间造成了背甲的巨大浪费，直至《中国药典》出版后，二者才被看作一个整体使用。中医认为龟甲具有滋阴潜、益肾健骨及养血补心的功效，常应用于阴虚潮热、骨蒸盗汗、虚风内动及筋骨痿软等症。现代药理学表明龟的腹甲还具有潜在的抗癌功效。然而，关于其背甲的抗癌活性尚未阐明。因此本发明有必要明确背、腹甲之间抗癌活性差异，以及进一步了解其差异的分子机制，这对龟背甲资源的充分开发利用和龟甲药理基础的深入研究具有重要意义。

2、龟甲化学成分是揭示其生物活性分子机制的关键环节，考虑到龟甲化学成分的多样性和复杂性，近些年来研究人员常借助代谢组学手段分析天然药物化学成分分布情况。非靶代谢组学是一种基于全谱分析的高通量的代谢组学技术，可有效分析同一样本不同部位化学成分分布和数量，目的是寻找差异性成分，解析样本中不同组织部位的表型差异原因。该技术具有发现未知的代谢物、检测覆盖度广及灵敏度高等优势。由于代谢组学手段仅能解析到影响其生物活性的化学成分方面，难以明确解析这些成分是如何影响其生物活性靶点及信号通路等分子作用机制。令人兴奋的是，网络药理学目前已广泛用于揭示中药生物活性的作用机制，具有多成分、多靶点及多通路的特征，为新药发现、疾病治疗和药物再利用等领域提供理论和实践支持。

3、因此，为了进一步明确背甲、腹甲抗癌活性方面的差异，并揭示其分子作用机制。本发明以中华草龟的龟甲作为研究对象，首先通过体外试验明确背甲、腹甲提取物在抗癌活性差异，随后借助非把代谢组学手段寻找背甲和腹甲提取物的差异成分，最后结合网络药理学作为突破口，来预测其差异的分子机制原因。这为背甲资源开发利用及其药效物质基础研究提供一定的理论指导。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于代谢组学结合网络药理学分析龟背、腹甲抗癌活性差异的方法。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种基于代谢组学结合网络药理学分析龟背、腹甲抗癌活性差异的方法，包括下列步骤：

3、步骤1：龟甲提取物的制备

4、将龟甲烘干，粉碎后得到龟甲粉；然后将龟甲粉加入水中，在55-80℃水浴中加热0.5-2h，重复1-5次；将上清液浓缩得到浓缩液，得到样品；

5、步骤2：采用mtt法检测样品对hepg2、rko、hela和u2514种癌细胞抗增值活性的影响

6、步骤3：代谢组学分析

7、使用液相色谱质谱联用技术对样品进行分析，包括样品制备、色谱分离和质谱检测；通过数据处理和峰识别步骤，得到化学成分的信息，并与数据库进行匹配、注释和数据处理，随后对处理的数据，进行差异代谢物筛选出ts_vs特有的上调化学成分；

8、步骤4：使用网络药理学明确样品活性成分、抗癌关键靶点、抗癌机制及抗癌有效成分。

9、优选的技术方案为：步骤2中，细胞培养：hepg2、rko和u251细胞系均在dmem培养基中培养，而hela使用rpmi 1640培养基，上述培养加中均添加10％v/v胎牛血清，并在相对湿度95％、37℃和5％ co2的二氧化碳培养箱中培养，直到细胞融合度达到70-80％时可进行传代；弃去旧培养基，加pbs，清洗2-3次，用0.25％胰蛋白酶消化2min，收集的细胞用于后续实验；

10、mtt试验：以上4种细胞系以2×104个细胞/ml的密度接种于96孔板中，在37℃、5％co2条件下培养24h；然后加入经过滤灭菌的不同浓度的龟甲提取物10μl；各浓度均设置3个复孔；随后继续培养48h，然后添加10μl的mtt试剂并孵育4h；弃去培养基后，向每个孔中加入110μl的甲酰胺增溶溶液，置摇床上低速震荡10min。使用酶标仪，于570nm处检测吸光度。

11、优选的技术方案为：步骤4包括：活性成分筛选、靶点收集及蛋白-蛋白相互作用构建；2)基因本体论富集和kyoto基因与基因组百科全书通路富集分析；3)药物-成分-靶点-通路-疾病网络构建。

12、优选的技术方案为：利用代谢组学筛选出样品特有化学成分，首先通过lc-ms技术对样品化学成分进行鉴定分析，具体包括：称取20mg样品，加入1000ul提取液(甲醇:乙腈:水＝2:2:1v/v，含同位素标记内标混合物；35hz研磨处理4min，冰水浴中超声5min；重复步骤2-3次；-40℃静置1h；将样品4℃，12000rpm离心15min；取上清于进样瓶中上机检测；所有样品另取等量上清混合成qc样品上机检测。

13、优选的技术方案为：lc-ms使用使用vanquish超高效液相色谱仪，通过watersacquity uplcbeh amide液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离；液相色谱a相为水相，含25mmol/l乙酸铵和25mmol/l氨水，b相为乙腈；样品盘温度：4℃，进样体积：2μl。

14、优选的技术方案为：活性成分筛选、靶点收集及蛋白-蛋白相互作用构建：首先通过tcmsp分析平台对ts_c上调化合物的活性成分进行筛选，筛选标准为ms2评分>0.75，口服生物利用度(ob)≥30％，药物相似度(dl)≥0.10。

15、优选的技术方案为：go和kegg分析：使用david对所选的共同靶点进行go富集和kegg通路富集分析；go和kegg通路富集分析结果分别使用r项目生成的条形图和气泡图进行可视化展示。

16、优选的技术方案为：药物-成分-靶点-通路-疾病(网络构建：根据kegg分析，将排名前20的关键kegg通路及其映射的靶点与相关的活性成分共同输入到一个类型为xlsx的文件中。

17、由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

18、1.本发明首次揭示龟背甲和腹甲抗癌活性存在差异，其中以背甲抗癌活性表现较佳。

19、2、本发明首次利用代谢组学结合网络药理学技术，从背甲提取物的特有化学成分、有效活性成分、作用靶点和途径等方面，分析其抗癌活性较好的分子机制。

20、3、基于以上技术，本发明还降低了龟甲生物活性的分析研究成本，拓宽了计算机网络技术在医疗领域的应用范围。

技术特征：

1.一种基于代谢组学结合网络药理学分析龟背、腹甲抗癌活性差异的方法，其特征在于：包括下列步骤：

2.根据权利要求1所述的基于代谢组学结合网络药理学分析龟背、腹甲抗癌活性差异的方法，其特征在于：步骤2中，细胞培养：hepg2、rko和u251细胞系均在dmem培养基中培养，而hela使用rpmi 1640培养基，上述培养加中均添加10%v/v胎牛血清，并在相对湿度95%、37°c和5% co2的二氧化碳培养箱中培养，直到细胞融合度达到70-80%时可进行传代；弃去旧培养基，加pbs，清洗2-3次，用0.25%胰蛋白酶消化2min，收集的细胞用于后续实验；

3.根据权利要求1所述的基于代谢组学结合网络药理学分析龟背、腹甲抗癌活性差异的方法，其特征在于：步骤4包括：活性成分筛选、靶点收集及蛋白-蛋白相互作用构建；2）基因本体论富集和kyoto基因与基因组百科全书通路富集分析；3）药物-成分-靶点-通路-疾病网络构建。

4.根据权利要求3所述的基于代谢组学结合网络药理学分析龟背、腹甲抗癌活性差异的方法，其特征在于：利用代谢组学筛选出样品特有化学成分，首先通过lc-ms技术对样品化学成分进行鉴定分析，具体包括：称取20 mg样品，加入1000 ul提取液(甲醇:乙腈:水=2:2: 1 v/v，含同位素标记内标混合物；35 hz研磨处理4 min，冰水浴中超声5 min；重复步骤2-3次；-40 ℃静置1 h;将样品4 ℃，12000 rpm离心15 min；取上清于进样瓶中上机检测；所有样品另取等量上清混合成qc样品上机检测。

5.根据权利要求4所述的基于代谢组学结合网络药理学分析龟背、腹甲抗癌活性差异的方法，其特征在于：lc-ms使用使用vanquish超高效液相色谱仪，通过waters acquityuplcbeh amide液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离；液相色谱a相为水相，含25 mmol/l乙酸铵和25 mmol/l氨水，b相为乙腈；样品盘温度：4 ℃，进样体积：2 μl。

6.根据权利要求1所述的基于代谢组学结合网络药理学分析龟背、腹甲抗癌活性差异的方法，其特征在于：活性成分筛选、靶点收集及蛋白-蛋白相互作用构建：首先通过tcmsp分析平台对ts_c上调化合物的活性成分进行筛选，筛选标准为ms2评分> 0.75，口服生物利用度(ob)≥30%，药物相似度(dl)≥0.10。

7.根据权利要求1所述的基于代谢组学结合网络药理学分析龟背、腹甲抗癌活性差异的方法，其特征在于：go和kegg分析：使用david对所选的共同靶点进行go富集和kegg通路富集分析；go和kegg通路富集分析结果分别使用r项目生成的条形图和气泡图进行可视化展示。

8.根据权利要求1所述的基于代谢组学结合网络药理学分析龟背、腹甲抗癌活性差异的方法，其特征在于：药物-成分-靶点-通路-疾病（网络构建：根据kegg分析，将排名前20的关键kegg通路及其映射的靶点与相关的活性成分共同输入到一个类型为xlsx的文件中。

技术总结
一种基于代谢组学结合网络药理学分析龟背、腹甲抗癌活性差异的方法，包括下列步骤：步骤1：龟甲提取物的制备；步骤2：采用MTT法检测样品对HepG2、RKO、HeLa和U2514种癌细胞抗增值活性的影响；步骤3：代谢组学分析；步骤4：使用网络药理学明确样品活性成分、抗癌关键靶点、抗癌机制及抗癌有效成分。一种基于代谢组学鉴别中华草龟背甲和腹甲的方法，本发明首次揭示龟背甲和腹甲抗癌活性存在差异，其中以背甲抗癌活性表现较佳。

技术研发人员：陆剑锋,任梦影,林琳,姜绍通
受保护的技术使用者：合肥工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8