牛轮状病毒信号增强型胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用

本发明涉及一种胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用，特别涉及一种用于检测牛轮状病毒的信号增强型胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用。本发明属于生物。

背景技术：

1、牛轮状病毒(bovine rotavirus，borv)是导致犊牛腹泻的主要病原之一，牛群感染病毒后导致发病率和死亡率的增加，给养牛业带来了巨大的经济损失。牛轮状病毒感染的潜伏期短，宿主感染后可长期排毒，病毒感染引起临床症状的严重程度不等。临床表现为发烧或伴有急性的呕吐，呕吐一般不超过24h，24-48h内有水样腹泻症状，腹泻症状通常持续3-8d，粪便常混有血液，颜色多为黄褐色。发病时病牛出现体温略微升高，食欲废绝、精神萎顿等症状。宿主动物感染后可能会出现脱水和电解质紊乱等症状。心血管衰竭和严重的脱水是导致患病动物死亡的主要原因。当犊牛感染轮状病毒时，由于抵抗力较差外加不规范的饲养环境等，常有继发细菌感染的情况出现。常见的细菌如沙门氏菌和大肠杆菌等，混合感染导致犊牛发病更急，病死率更高。

2、牛轮状病毒感染成年牛常表现为隐性感染，临床症状不明显，由于感染borv与其他细菌和病毒引起的腹泻性疾病症状相似，导致确诊困难。因此建立一种快速、有效的检测牛轮状病毒的方法对该病的综合防控具有重要的实践意义。

3、目前，牛轮状病毒的检测方法有病毒的分离培养、间接免疫荧光、电镜观察、rt-pcr、elisa等。但这些检测方法均需要特殊的检测设备以及专业的操作技术人员，不适合现地检测。胶体金试纸条检测方法的制备成本较低，携带方便，检测时间短，可直接通过肉眼观察，不需要特殊设备，且操作简单，不要求专业人员，尤其适用于现地和基层使用。胶体金试纸条的检测范围也非常广泛，可用于检测不同的临床样品，如尿、唾液、粪样、全血、血清、血浆、体液等。检测时不需要大量样品，且样品仅需简单处理或不处理即可直接检测。但是传统胶体金试纸条与pcr、elisa等方法相比，检测灵敏度较差。周华倩建立了牛支原体的抗体检测胶体金免疫层析试纸条，并应用建立的试纸条对81份阳性血清和61阴性血清临床样品进行检测，结果显示与商品化elisa试剂盒相比，试纸条与试剂盒阳性符合率为90.12％，阴性符合率为98.36％。刘亚东建立的牛源布鲁氏菌外膜蛋白胶体金试纸条，对牛血清样品进行检测结果显示，与标准化试剂盒相比，试纸条的检测符合率为94.2％。因此，如何提高免疫层析检测方法的灵敏度成了研究者的主要目标。

4、为此，本发明通过制备borv多克隆抗体和单克隆抗体，利用酶信号放大系统提高检测灵敏度，研制一种灵敏度更高的信号增强型胶体金免疫层析试纸条，为borv的快速诊断提供一种快速、敏感、特异的现地检测方法，为监测和防控borv流行提供一种有效的技术手段。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种牛轮状病毒信号增强型胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用。

2、为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

3、本发明基于酶信号放大检测信号体系，建立了检测borv的信号增强型胶体金免疫层析试纸条。以borv为免疫原，免疫家兔制备多克隆抗体，将多克隆抗体纯化后作为捕获抗体。繁殖borv并进行纯化，免疫balb/c小鼠，利用体外细胞融合技术，将免疫后脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，经过多次亚克隆与筛选，最终获得4株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为borv-1a10、borv-5d7、borv-3d4、borv-3b3。其中borv-1a10、borv-5d74分泌抗体亚类为igg3，borv-3d4、borv-3b3分泌抗体亚类为igm。elisa和间接免疫荧光实验(ifa)结果表明，4株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均能与borv发生特异性反应。其中borv-3d4杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定，效价较高，故将borv-3d4杂交瘤细胞腹腔注射balb/c小鼠制备腹水，腹水效价为1:105。elisa和ifa结果表明腹水可与borv特异性结合，具有良好的反应活性，可作为试纸条的检测抗体。同时，制备胶体金颗粒，并对其进行质量鉴定。结果表明制备的胶体金颗粒在储存2个月后无变质情况，在电镜下形态呈圆形或椭圆形，分散性好，可用于后续研究。在制备金标抗体与酶的缀合物时，先用辣根过氧化物酶(hrp)标记检测抗体，再将酶标检测抗体标记胶体金颗粒，并优化标记ph值和抗体标记量，结果显示，稳定1ml胶体金所需单抗蛋白量为58.92μg/ml，最适标记ph值为8.5。利用斑点免疫金染色法鉴定金标抗体，结果可见明显红色斑点，可用于进行后续实验。

4、胶体金垫和样品垫处理液测试结果显示，处理液(0.1％v/v tween-20、5％w/v蔗糖、0.1％w/vpva、1％w/v bsa)金标抗体释放和吸收效果最好，处理液(0.05％v/v tween-20、5％w/v蔗糖、0.5％v/v triton x-100、0.5％w/v bsa)样品释放的效果最好，检测线的显色条带最亮。对抗体包被液和nc膜封闭液的测试结果显示，0.01mol/l pb溶液组包被稀释液效果最好，质控线和检测线无中空现象，颜色鲜艳，条带清晰。3％bsa溶液的封闭效果最好，背景颜色最浅，层析时间最短。实验结果表明，包被质控线(c线)的山羊抗小鼠igg浓度为1mg/ml，包被检测线的borv多抗浓度为5mg/ml。组装信号增强型胶体金试纸条后，对其进行敏感性检测，结果表明，该试纸条对borv的最小检出量约为103个tcid50，与传统试纸条相比，检测灵敏度提高了10倍。特异性实验结果显示，该试纸条与bpv、bvdv和brsv均无交叉反应，具有良好的特异性。重复性实验结果表明，批间和批内检测变异系数均小于10％，表明试纸条具有良好的重复性。最后，对220份临床样品的检测，该试纸条检测出8份阳性样品，rt-pcr检测出9份阳性样品，与rt-pcr法相比符合率为88.89％。

5、在上述研究的基础上，本发明提出了一种牛轮状病毒信号增强型胶体金免疫层析试纸条，所述的试纸条包括从左到右依次连接的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜(nc膜)、吸水垫，还包括位于下方的pvc板，其中pvc板的作用是提供组装平台，硝酸纤维素膜上具有山羊抗鼠igg喷涂的质控线，以及兔抗牛轮状病毒多克隆抗体喷涂的检测线，胶体金垫上涂覆有辣根过氧化物酶标记的鼠抗牛轮状病毒的单克隆抗体与胶体金颗粒的缀合物，样品垫提供了待测样品加入的位置；

6、其中，所述的鼠抗牛轮状病毒单克隆抗体是由分泌牛轮状病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株产生，所述的分泌牛轮状病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株命名为borv-3d4，其菌种保藏编号为cgmcc no.45549。

7、其中，优选的，胶体金垫在涂覆辣根过氧化物酶标记的鼠抗牛轮状病毒的单克隆抗体与胶体金颗粒的缀合物前使用含有0.1％v/v tween-20、5％w/v蔗糖、0.1％w/vpva、1％w/v bsa的胶体金垫处理液进行浸泡处理；样品垫使用含有0.05％v/v tween-20、5％w/v蔗糖、0.5％v/v triton x-100、0.5％w/v bsa的样品垫处理液进行浸泡处理。

8、其中，优选的，山羊抗鼠igg以及兔抗牛轮状病毒多克隆抗体采用0.01mol/l pb溶液进行稀释。

9、其中，优选的，包被质控线的山羊抗小鼠igg浓度为1mg/ml，包被检测线的兔抗牛轮状病毒多克隆抗体的浓度为5mg/ml。

10、其中，优选的，硝酸纤维素膜采用3％w/v bsa溶液进行封闭。

11、其中，优选的，所述的缀合物是先将辣根过氧化物酶标记在鼠抗牛轮状病毒的单克隆抗体上，再将标记好的抗体与酶的复合物标记在胶体金颗粒上得到的。

12、其中，优选的，1ml胶体金所需单克隆抗体蛋白量为58.92μg/ml，标记ph值为8.5。

13、进一步的，本发明还提出了所述的牛轮状病毒信号增强型胶体金免疫层析试纸条在制备检测牛轮状病毒试剂中的应用。

14、相较于现有技术，本发明的有益效果是：

15、1、本发明制备了抗borv的单克隆抗体和多克隆抗体，研制了用于检测borv的信号增强型胶体金试纸条，并对试纸条的组装条件进行优化，为牛轮状病毒诊断提供一种简便、快速、灵敏的现地检测方法。

16、2、本发明通过将偶联标记hrp的抗体标记在胶体金的表面，利用tmb显色液增强显色，利用酶信号放大检测效果，并通过对试纸条胶体金垫、样品垫处理液、检测线抗体浓度等条件进行摸索，优化试纸条反应条件。此项技术的关键在于要先将hrp直接标记在抗体上，再将标记好的抗体与酶的复合物标记在胶体金颗粒上。在检测过程结束后，先用蒸馏水冲洗试纸条，再向试纸条上滴加tmb进行显色，显色不会溶解并能沉积在质控线和检测线上。这种方法可使检测线的颜色加深，进而呈现更加明显的检测效果。与传统胶体金检测方法相比，检测灵敏度提高了10倍。