本发明涉及体外诊断领域,公开了一种用于a2-纤溶酶抑制物活性测定试剂盒及制备方法。
背景技术:
1、纤溶酶的纤溶作用可溶解血栓,而纤溶酶在血液中被激活后,会迅速与a2-抗纤溶酶(a2-pi)结合,形成纤溶酶-a2-抗纤溶酶复合物,然后失活,纤溶酶的活性降低是导致血栓形成的重要机制之一。
2、a2-pi是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的重要成员,可直接抑制纤溶酶的活性,在体内纤溶调节机制中起关键作用。a2-pi通过3种方式调节纤溶:①通过与纤溶酶形成复合物:a2-pi对游离的纤溶蛋白的抑制比对结合在纤维蛋白凝块上的纤溶蛋白更为高效,这使得纤溶蛋白在纤维蛋白凝块上结合,防止/抑制纤溶酶的激活。②通过抑制纤维蛋白凝块上的纤溶酶吸附:a2-pi通过fxiiia共价结合到纤维蛋白凝块中,使纤维蛋白凝块溶解力降低。③通过阻止纤溶酶原与纤维蛋白凝块的结合:a2-pi的c端既可与纤溶酶原的赖氨酸结合,也可以与纤维蛋白结合。
3、检测人体内a2-pi的活性有助于判断体内的纤溶状态,用于出血、血栓性疾病的辅助诊断。临床上使用分光光度计法、免疫化学法测定a2-pi的活性,其结果易受各种因素的影响,检测结果的重复性较差、抗干扰能力差,无法反映患者体内真实的a2-pi活性水平。在静脉和动脉血栓形成时(如血栓性静脉炎)、心肌梗塞、分娩后等情况下会导致a2-pi活性增高;严重肝病(如肝硬化)、dic、手术后以及先天性缺乏症等疾患可导致a2-pi活性减低。
4、由于现有检测技术的不足,以及临床上对a2-纤溶酶抑制物活性检测需求的提升,研究一种准确度高、稳定性好、用于a2-纤溶酶抑制物活性测定试剂盒及制备方法有重要意义。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种用于a2-纤溶酶抑制物活性测定试剂盒及制备方法,以解决上述背景技术中提出的问题。
2、为了解决上述技术问题,本发明提供如下技术方案:
3、一种用于a2-纤溶酶抑制物活性测定试剂盒的制备方法:所述试剂盒包括r1试剂、r2试剂、r3试剂;所述r1试剂包括发色底物、缓冲体系、冻干赋形剂、抗干扰成分、防腐剂中的至少一种;所述r2试剂包括重组兔纤溶酶、缓冲体系、冻干赋形剂、冻干保护剂、防腐剂中的至少一种;所述r3试剂包括缓冲液、防腐剂中的至少一种。
4、较为优化地,所述缓冲体系包括hepes、tris、磷酸缓冲盐溶液中的至少一种;缓冲体系的浓度为10~100mm,ph为7.0~7.6。
5、较为优化地,所述防腐剂包括叠氮化钠、proclin300、prionex中的至少一种;r1试剂、r2试剂和r3试剂中防腐剂浓度为0.1~0.5ml/l。
6、较为优化地,所述发色底物包括h-d-缬氨酰-l-亮氨酸-l-赖氨酰-p-硝基苯胺·二盐酸盐(s-2251),浓度为1~3mmol/l。
7、较为优化地,冻干赋形剂包括牛血清白蛋白、甘氨酸中的至少一种;牛血清白蛋白(bsa)浓度为2.5~7.5g/l,甘氨酸浓度为30~50g/l;r2中冻干保护剂包括明胶、甘油。
8、较为优化地,r1试剂中的抗干扰成分包括亚硝酸盐、非离子型表面活性剂、表面活性剂中的至少一种;非离子表面活性剂包括多聚环氧乙烷脂肪醇类、多聚环氧乙烷-环氧丙烷脂肪醇类、聚乙二醇烷基醚类、十二烷基苯磺酸钠、混合脂肪酸甘油酯类中的至少一种。
9、较为优化地,所述重组兔纤溶酶的浓度为4~8iu/ml。
10、较为优化地,所述r1试剂、r2试剂为冻干试剂,r3试剂为液体试剂。
11、较为优化地,r1试剂、r2试剂、r3试剂中,缓冲体系浓度、防腐剂浓度需保持一致。
12、较为优化地,以上原料的配置过程中皆使用电导率≤1μs/cm(25℃)的纯化水。
13、与现有技术相比,本发明所达到的有益效果是:本发明提供一种a2-抗纤溶酶活性测定试剂盒,通过使用重组兔纤溶酶和发色底物为试剂原料,二者搭配使用时,试剂盒的线性范围宽、抗干扰能力强、重复性性好、稳定性好,可以实现对进口a2-pi活性测定试剂盒的替代,充分满足临床检验的需求,成本仅为进口试剂盒的三分之一,降低了医院购买检测试剂盒的费用,也降低了病人的检测费用。
1.一种用于a2-纤溶酶抑制物活性测定试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括r1试剂、r2试剂、r3试剂;所述r1试剂包括发色底物、缓冲体系、冻干赋形剂、抗干扰成分、防腐剂;所述r2试剂包括重组兔纤溶酶、缓冲体系、冻干赋形剂、冻干保护剂、防腐剂;所述r3试剂包括缓冲体系、防腐剂。
2.根据权利要求1所述的一种用于a2-纤溶酶抑制物活性测定试剂盒,其特征在于:所述缓冲体系包括hepes、tris、磷酸缓冲盐溶液中的至少一种;缓冲体系的浓度为10~100mm,ph为7.0~7.6。
3.根据权利要求1所述的一种用于a2-纤溶酶抑制物活性测定试剂盒,其特征在于:r1试剂、r2试剂和r3试剂中防腐剂包括叠氮化钠、proclin300、prionex中的至少一种;r1试剂、r2试剂和r3试剂中防腐剂浓度为0.1~0.5ml/l。
4.根据权利要求1所述的一种用于a2-纤溶酶抑制物活性测定试剂盒,其特征在于:r1试剂中发色底物包括h-d-缬氨酰-l-亮氨酸-l-赖氨酰-p-硝基苯胺·二盐酸盐,浓度为1~3mmol/l。
5.根据权利要求1所述的一种用于a2-纤溶酶抑制物活性测定试剂盒,其特征在于:冻干赋形剂包括牛血清白蛋白、甘氨酸中的至少一种;牛血清白蛋白浓度为2.5~7.5g/l,甘氨酸浓度为30~50g/l;r2试剂中冻干保护剂包括明胶、甘油。
6.根据权利要求1所述的一种用于a2-纤溶酶抑制物活性测定试剂盒,其特征在于:r1试剂中的抗干扰成分包括亚硝酸盐、非离子型表面活性剂、表面活性剂中的至少一种;非离子表面活性剂包括多聚环氧乙烷脂肪醇类、多聚环氧乙烷-环氧丙烷脂肪醇类、聚乙二醇烷基醚类、十二烷基苯磺酸钠、混合脂肪酸甘油酯类中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的一种用于a2-纤溶酶抑制物活性测定试剂盒,其特征在于:r2试剂中重组兔纤溶酶的浓度为4~8iu/ml。
8.根据权利要求1所述的一种用于a2-纤溶酶抑制物活性测定试剂盒,其特征在于:所述r1试剂、r2试剂为冻干试剂,r3试剂为液体试剂。
9.根据权利要求1所述的一种用于a2-纤溶酶抑制物活性测定试剂盒,其特征在于:r1试剂、r2试剂、r3试剂中,缓冲体系浓度、防腐剂浓度一致。
10.一种用于a2-纤溶酶抑制物活性测定试剂盒的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:取发色底物、缓冲体系、冻干赋形剂、抗干扰成分、防腐剂,混合均匀得r1试剂;取重组兔纤溶酶、缓冲体系、冻干赋形剂、冻干保护剂、防腐剂,搅拌均匀得r2试剂;取缓冲体系、防腐剂,搅拌均匀得r3试剂;将r1试剂、r2试剂、r3试剂分别装瓶,得试剂盒。