可溶性生长刺激表达基因2蛋白（ST2）检测试剂盒的制作方法

本发明涉及免疫医学检测，具体是指可溶性生长刺激表达基因2蛋白(st2)检测试剂盒。

背景技术：

1、生长刺激表达基因2蛋白(growth stimulation expressed gene 2,st2)是白介素1受体家族的成员，其中可溶性st2(sst2)和跨膜型st2(st2l)是心力衰竭(hf)的主要研究对象。st2在免疫和炎症反应中起到关键作用。2013acc/aha/hfsa心衰指南指出，可溶性st2为一个心肌纤维化的标志物，可以预测心衰患者的入院和死亡概率，还可以为利钠肽类增加额外的预测价值。st2有一些独特的优点，如检测结果不受原有心血管疾病、房颤、年龄、提质量指数等影响，而nt-probnp的浓度值随着肾功能的衰减显著升高(bayes-genisetal.2013jcf)。研究发现，当急性失代偿性心衰患者st2>35ng/ml时，死亡和因心衰再住院风险显著增高。pride研究表明，st2可以预测急性心衰患者30天的死亡率。在急性发病后前30天就可通过检测st2识别出高风险患者，预测价值达一年以上。st2动态检测有助于预测住院心衰患者出院后因心衰再住院的风险。慢性心衰患者st2浓度与一年内死亡率成正相关，其测定值在最高十分位人群一年死亡率超过50％。可溶性st2作为hf的一种新型生物标志物，目前已被纳入美国心衰管理指南和《中国心心力衰竭诊断和治疗指南2014》，主要用于评估急性心力衰竭和慢性心力衰竭病人的危险分级、预后并指导医生药物治疗。

2、目前市售的可溶性st2的免疫检测方法主要是酶联免疫法。酶联免疫法(elisa)检测原理，以双抗体夹心法为例，是在固相载体上包被一种特异性抗体，加入待测样本后，再加入酶标记的另一种抗体，形成双抗体夹心复合物，再通过发光底物的显色作用，使仪器可以定量检测出的免疫反应。国内已申请专利的可溶性st2检测技术包括胶体金免疫层析法(公开号cn204514934μ)和磁微粒化学发光法(公开号cn110208549a、cn108152486a)等。

3、免疫层析(ica)作为一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合从而实现特异性的免疫诊断。目前主要的检测方法为胶体金法、荧光免疫层析、荧光微球层析、时间分辨荧光免疫测定等。而胶体金免疫层析法作为即时检验(point-of-care testing,poct)的一种方法，具有上样量少、简便快速的优点，适用于床旁检验。其原理如下，仍以双抗体夹心法为例，当含有抗原的样本滴加到吸收孔后，抗原先与胶体金标记的抗体结合形成抗原-抗体复合物，然后固定在样品垫上的另一种抗原会捕获该复合物，形成双抗体夹心复合物，红色的检测线就会显示出来，并且检测线上复合物越多，光密度越大。

4、磁微粒化学发光法作为近年来逐渐兴起的一种免疫检测技术，是将免疫反应系统、磁性分离技术和化学发光技术紧密结合的产物，主要分为直接化学发光和间接化学发光。其中磁微粒酶促化学发光技术属于典型的间接化学发光，是以酶标记抗体，与样本中的抗原进行免疫反应形成复合物，再连接在磁微粒上，在外加磁场中将免疫复合物与未结合的其他物质分离，免疫复合物上的酶再作用于其相应的底物，从而实现化学发光。其中，常用的标记酶主要有碱性磷酸酶(alp)和辣根过氧化物酶(hrp)。直接化学发光是标记物直接标记抗体，与待测物形成复合物，在碱性/酸性条件下，加入强氧化剂，瞬间发光，产生的光子能与待测物的量成正比的一种技术。常用的标记物有吖啶酯等。

5、酶联免疫吸附法(elisa)，存在着检测周期较长、灵敏度低、操作繁琐和线性范围较窄等缺点。目前市售的elisa试剂盒，其检测时长约4-6小时，灵敏度为1.8ng/ml，线性范围为3-200ng/ml。这些缺陷导致其无法及时有效的帮助医生判断病人的情况。

6、胶体金免疫层析由于是人工操作，因此操作误差大，精密度和重复性相对较差，灵敏度和线性范围较差，检测结果易受外界环境影响。

7、酶促化学发光(cn107991485a)由于常用的辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶的成本较高，而导致检测成本较高；且酶容易受外界因素如温度等影响，从而干扰检测结果。以及底物到达平台期时间较长，从而降低了检测速度。目前国内已申请的专利磁微粒酶促化学发光法(公开号cn110208549a)，其灵敏度为1ng/ml，检测范围为1-300ng/ml，批内变异系数在±10％范围内。国内已申请的专利磁微粒化学发光检测试剂(cn108152486a)是人工操作，存在一定的操作误差。

8、因此，亟需一种能够快速、准确且能够高灵敏度、高特异性的磁珠化学发光检测试剂盒。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服以上技术缺陷，提供可溶性生长刺激表达基因2蛋白(st2)检测试剂盒。

2、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：包括所述试剂盒包含第一试剂，第二试剂，校准品，抗试剂、磁微粒试剂、发光底物。

3、其中所述第一试剂包含磁微粒偶联的st2蛋白抗体、30g/l的电解质、20-70g/l的促进剂、0.5-10g/l防腐剂、1-20g/l表面活性剂和ph为6.5-9.5的1-100mmol/l的缓冲液；

4、所述第二试剂包含酶标记的st2蛋白抗体或其抗原结合片段，按w/v计0.05％-5％的带有羧基的聚苯乙烯微球，和ph为5.5～9.5的1-200mmol/l的缓冲液。

5、所述校准品是通过在1l的新生牛血清中加入0.03g～0.06g的四环素和0.5g～0.8g的硫酸新霉素，完全溶解后经过0.3μm滤膜处理制备而成。

6、作为优选的，所述酶标记的st2蛋白抗体的浓度为大于或等于2.5ng/ml，且小于或等于4.5ng/ml。

7、作为优选的，所述抗试剂缓冲液的制备：5～10na 2po 3h·12h 2o、2～4的napo3h2·12h2o、2～56的绵羊血清、35～15的新生牛血清、1g～3g的马血清加入1l纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用4m hc1调节ph至5～6，制得所述抗试剂缓冲液。

8、作为优选的，所述第二试剂的终浓度为0.1～3μg/ml；优选为1.25～2μg/ml；更优选为1.5～1μg/ml；

9、作为优选的，所述的可溶性生长刺激表达基因2蛋白(st2)检测试剂盒的应用：包括以下步骤:

10、(1)依次混合待测样品、第一试剂、第二试剂，依次混合校准品、抗试剂、磁微粒试剂、，分别孵育并洗涤后加入发光底物；

11、(2)检测所述发光底物的相对发光强度，通过检测得到的相对发光强度，计算st2蛋白的浓度；其中，所述裸st2蛋白抗体与所述酶标记的st2蛋白抗体用以竞争性地结合待测抗原。

12、有益效果，本发明与现有的技术相比的优点在于：

13、1、该试剂盒将化学发光技术与磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，并且采用了一步法反应模式，使得检测灵敏度、精密性大大提高、检测范围扩大，反应时间大大缩短，从开始加样到检测结果，时间少于20min,明显快于同类试剂盒；

14、2、试剂盒中校准品、质控品、发光底物液和浓缩洗液均是该反应体系下的最优配方，给该试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障；

15、3、本发明可以在全自动化学发光仪上同时测定多个样本，实现可溶性生长刺激表达基因2蛋白的高通量快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率有了较大的提高。