一种检测脓毒症的联检试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药，特别涉及一种检测脓毒症的联检试剂盒及其应用。

背景技术：

1、脓毒症是一种严重威胁人类健康的疾病，根据相关研究统计：在全球每年约有3150万人感染脓毒症，其中约有1940万人为严重脓毒症患者，而最终530万人死亡。很多脓毒症研究主要纳入发达国家的相关临床数据，而实际情况中欠发达或发展中国家及地区脓毒症发病率和死亡率更高。2020年针对我国44所医院icu研究报告显示，脓毒症发病率达20.6%，病死率达35.5%，严重脓毒症病死率则高达50%。自1991年脓毒症的概念和诊断标准被提出来后，30年间，其诊断标准和定义历经演进，在2016年提出最新的脓毒症3.0定义是指宿主对感染产生的失控反应，并出现危及生命的器官功能障碍的临床综合征，采用“感染＋sofa≥2”的诊断标准。sofa评分涵盖了呼吸系统、血液系统、循环系统、神经系统肝脏、肾脏等人体6大（器官）系统，检测项目多，主要用于重症医学科，在实际的门诊、急诊具有较大的局限性；针对患者感染则使用血培养的方式对病原体进行检测，然而其培养周期较长，需24-48h，在患者使用抗生素治疗后，极易出现假阴性。

2、即便现有的诊断标准量化了脓毒症相关器官损伤标准，如何快速、精准鉴别和诊断脓毒症是当前医学界需要探索的问题。伴随基因组学、蛋白组学等技术的蓬勃发展，使用生物标志物对疾病进行辅助诊断已日趋寻常，2020年中国脓毒症早期预防与阻断急诊专家共识提出将反应蛋白(crp)、降钙素原(pct)、白细胞介素(il-6)和淀粉样蛋白(saa)应用于脓毒症预防和诊断感染；虽然上述标志物在人体内含量高低对评估脓毒症患者感染状态和预后具有一定的参考意义，但由于脓毒症复杂的免疫反应状态和病理情况，上述标志物仍不能准确提供患者体内导致其反应紊乱的源头，是否发生脓毒症感染仍需要借助血培养和其他生理变化等方式确认；其次上述标志物检测常使用到生化分析仪或流式细胞仪等仪器，其设备昂贵，对人员的技术要求较高，较难应用在经济、基础设施欠发达的基层医院。因此，使用合适的生物标志物组合对脓毒症早期诊断和快速识别具有广阔应用前景，为脓毒症患者病程评估和个性化诊治提供了有效的方案。

技术实现思路

1、本发明提供了一种检测脓毒症的联检试剂盒及其应用，对于脓毒症的诊断具有较高的灵敏度和特异性，并能区分细菌感染、病毒感染与脓毒症，能够大幅缩短检测时间，且降低检测成本。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、cd14、cd95、hbp、hmgb-1、ifn-α、ifn-γ、il-1β、il-8、mip-1β、mif、pct、tnf-α、strem-1、tlr-4、tsp-1中的至少两种标志物联合在检测脓毒症中的应用。

4、通过对相关样本在免疫维度上测试，实现脓毒症早期分级筛查的应用，并区分细菌感染、病毒感染与脓毒症。

5、本申请的第二个方面，提供了一种检测脓毒症的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6、（1）检测样本的cd14、cd95、hbp、hmgb-1、ifn-α、ifn-γ、il-1β、il-8、mip-1β、mif、pct、tnf-α、strem-1、tlr-4、tsp-1中的至少两种标志物的浓度；

7、（2）对测定的样本中的标志物的浓度进行logistic回归或支持向量机（svm）分析算法，建立计算模型。

8、进一步地，所述logistic回归方程为：

9、

10、其中，为脓毒症标志物的logistic回归模型结果，为回归得到的自然常数，为回归分析得到的每个标志物的系数，为每个标志物的浓度，为大于或等于2的整数。

11、将检测的每个样本的生物标志物浓度代入回归方程，计算出每个样本患脓毒症的概率，通过距离roc曲线左上角最近的一点的约登指数确定概率的截断值(cut-off)，当logit(p)大于上述截断值时，存在罹患脓毒症的风险，可提醒医生或病人此时需要进一步检查确诊。

12、作为一种优选的实施方案，所述步骤（1）中的样本为人的血液、尿液、脑脊液、粪便、痰液、或组织液。

13、作为一种优选的实施方案，所述步骤（1）中的标志物的浓度检测方法为：放射方法、免疫方法、荧光方法、流式荧光法、胶乳比浊法、生化法、酶法、杂交法、气质联用法、液质联用法、核酸质谱、层析法、化学发光方法、磁电法或光电转换方法的至少一种。

14、本申请的第三方面，提供一种检测脓毒症的联检试剂盒，包括cd14、cd95、hbp、hmgb-1、ifn-α、ifn-γ、il-1β、il-8、mip-1β、mif、pct、tnf-α、strem-1、tlr-4、tsp-1中的至少两种标志物的捕获抗体和检测抗体。

15、将患者的血液、尿液、脑脊液、粪便、痰液、或组织液等样本加入到试纸卡加样区，在一定时间内将试剂卡插入干式荧光免疫分析仪内进行读数，仪器上显示上述至少两种生物标志物组合含量的数值；搭配算法，基于读出的生物标志物含量代入到逻辑回归方程计算脓毒症患病概率。

16、本发明的有益效果为：

17、1. 本发明通过临床实验检测相关样本，将cd14、cd95、hbp、hmgb-1、ifn-α、ifn-γ、il-1β、il-8、mip-1β、mif、pct、tnf-α、strem-1、tlr-4、tsp-1至少两种生物标志物组合在脓毒症诊断的应用，在免疫维度通过检测血液、尿液、脑脊液、粪便、痰液、或组织液等相关样本，结合算法建立模型，实现了脓毒症的早期诊断筛查并能区分细菌感染、病毒感染与脓毒症。在脓毒症全身炎症反应和代偿性抗炎症反应阶段均具备良好的诊断结果；在特异性98%条件下，其诊断的敏感度可到98%，远远高于市场上的同类产品，填补了国际空白，此检测体系在国际上系首家报道，诊断技术和性能达到国内外先进水平。

18、2.本发明在对病人样本进行收集、上样测试后，经算法快速演算即可预测病人病程，时间花费仅15-30min，可快速辅助指导医生对患者病情进行干预，提高病人的治愈率。

19、3.本发明对标志物浓度快速检测仅需通过试剂盒与干式荧光免疫分析仪即可实现定量检测，结合算法快速演算，应用于门诊、急诊的初筛，实现低成本的脓毒症筛查。

技术特征：

1.cd14、cd95、hbp、hmgb-1、ifn-α、ifn-γ、il-1β、il-8、mip-1β、mif、pct、tnf-α、strem-1、tlr-4、tsp-1中的至少两种标志物联合在检测脓毒症中的应用。

2.一种检测脓毒症的方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的一种检测脓毒症的方法，其特征在于，所述logistic回归方程为：

4.根据权利要求2所述的一种检测脓毒症的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的样本为人的血液、尿液、脑脊液、粪便、血液、尿液、脑脊液、粪便、痰液、或组织液或组织液。

5.根据权利要求2所述的一种检测脓毒症的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的标志物的浓度检测方法为：放射方法、免疫方法、荧光方法、流式荧光法、胶乳比浊法、生化法、酶法、杂交法、气质联用法、液质联用法、核酸质谱、层析法、化学发光方法、磁电法或光电转换方法的至少一种。

6.一种检测脓毒症的联检试剂盒，其特征在于，所述联检试剂盒包括cd14、cd95、hbp、hmgb-1、ifn-α、ifn-γ、il-1β、il-8、mip-1β、mif、pct、tnf-α、strem-1、tlr-4、tsp-1中的至少两种标志物的捕获抗体和检测抗体。

技术总结
本发明涉及生物医药技术领域，公开了一种检测脓毒症的联检试剂盒及其应用，其公开了CD14、CD95、HBP、HMGB‑1、IFN‑α、IFN‑γ、IL‑1β、IL‑8、MIP‑1β、MIF、PCT、TNF‑α、sTREM‑1、TLR‑4、TSP‑1中的至少两种标志物联合在检测脓毒症中的应用，通过检测血液、尿液、脑脊液、粪便、痰液、或组织液等相关样本，结合算法建立模型，实现了脓毒症的早期诊断筛查，并能区分细菌感染、病毒感染与脓毒症。在脓毒症全身炎症反应和代偿性抗炎症反应阶段均具备良好的诊断结果；在特异性98%条件下，其诊断的敏感度可到98%，远远高于市场上的同类产品，填补了国际空白，此检测体系在国际上系首家报道，诊断技术和性能达到国内外先进水平。

技术研发人员：张皓洋,徐爱华,吕莹,高鹏
受保护的技术使用者：浙江格物致知生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15