一种沙棘的药物制剂的指纹图谱的构建方法及含量测试方法与流程

本发明涉及中药检测领域，具体涉及一种沙棘的药物制剂的指纹图谱的构建方法及含量测试方法。

背景技术：

1、沙棘配方颗粒是通过对中药沙棘进行提取、浓缩、制粒所得。沙棘为胡颓子科植物沙棘hippophae rhamnoides l.的干燥成熟果实，秋、冬二季果实成熟或冻硬时采收，除去杂质，干燥或蒸后干燥。主要包括黄酮类、三萜类、酚类、维生素类、甾醇、氨基酸、脂肪酸、有机酸、糖以及微量元素等成分，用于脾虚食少，食积腹痛，咳嗽痰多，胸痹心痛，瘀血经闭，跌扑瘀肿。

2、中国药典2020年版对沙棘的质量控制包括原植物品种、饮片炮制、饮片性状、理化鉴别等项目，文献也对沙棘中化学成分进行阐述，包括主要有效成分黄酮类成分研究等。然而，一方面，通过上述单一成分的含量测定或鉴别沙棘配方颗粒，不能从整体上检测和控制其质量；另一方面，通过单一成分的含量测定联合其他成分的鉴别沙棘配方颗粒，费时、费力，难以广泛地应用于生产实践。

3、而现有技术中，对沙棘的质量控制都是针对沙棘药材，并非是针对沙棘的药物制剂，现有技术中针对沙棘药材的构建方法并不能适用于沙棘的药物制剂。因此，建立一种能够全面地、快速地检测沙棘的药物制剂的方法，对于其全面质量检测和整体质量控制具有重要意义。

技术实现思路

1、因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种沙棘的药物制剂的指纹图谱的构建方法及含量测试方法，该方法根据沙棘的药物制剂的特点，建立该品种的指纹图谱，实现各特征峰有效分离，提高特征峰的个数，提高分离效果，能够快速、全面地检测沙棘的药物制剂。

2、为此，本发明提供了一种沙棘的药物制剂的指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：

3、(1)供试品溶液的制备；

4、(2)取供试品溶液采用超高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为为填充剂，以乙腈-水或乙腈-含酸的水溶液为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→5min→12min→25min→45min→50min，流动相中乙腈的体积百分数为：4％-5％→5％→15％→18％-22％→45％→45％。

5、进一步的，采用规格为150×2.1mm，1.9μm或150×2.1mm，1.8μm的色谱柱；和/或，含酸的水溶液中的选自磷酸、甲酸、乙酸中的至少一种；和/或，所述含酸的水溶液中酸的体积百分数为0.05-0.1％；和/或，检测波长为215nm-325nm，柱温为25-35℃，流速为0.25-0.35ml/min。

6、进一步的，梯度洗脱程序优选为：0→5min→12min→25min→45min→50min，流动相中乙腈的体积百分数为：5％→5％→15％→18％→45％→45％。

7、进一步的，所述检测波长优选为260nm，检测柱温优选为30℃，流速优选为0.3ml/min，流动相优选为磷酸水-乙腈，含酸水溶液中酸的体积百分数优选为0.05％。

8、进一步的，所述色谱柱选自于dikma endeavorsil c18、shim-pack gist c18-aq、waters acquity uplc hss t3中的一种，优选为shim-pack gist c18-aq。

9、进一步的，所述供试品溶液的制备方法为：称取供试品，加入溶剂，称定重量后提取，冷却后再次称定重量，用溶剂补足减失的重量，固液分离，取液体，即得；优选的，所述供试品溶液还满足如下a-e中的一项或多项；

10、a、供试品溶液的质量与溶剂的体积之比为0.5-1g：25ml-50ml；

11、b、提取方式为回流提取或超声提取；优选的，所述超声提取的功率为100w-500w；

12、c、提取时间为≥15min，优选为15-45min；

13、d、所述固液分离选自离心或者滤膜过滤；

14、e、溶剂选自体积分数为20％以上的甲醇水溶液、20％以上的乙醇水溶液、甲醇、乙醇中的至少一种。

15、进一步的，所述构建方法还包括采用原儿茶酸、水仙苷、槲皮素-3-o-槐二糖-7-o-鼠李糖苷、异鼠李素-3-o-槐二糖-7-o-鼠李糖苷、异鼠李素-3-o-葡萄糖-7-o-鼠李糖苷、芦丁、异槲皮苷、异鼠李素-3-o-葡萄糖苷、田基黄苷、槲皮素、异鼠李素中的至少一种为对照品加溶剂制备对照品溶液的步骤，以及按照上述任一所述的构建方法中的超高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品图谱的步骤；优选的，所述溶剂选自体积分数为20％以上的甲醇水溶液、20％以上的乙醇水溶液、甲醇、乙醇中的至少一种；优选的，1ml对照品溶液中含各对照品2-600μg。

16、进一步的，所述溶剂优选为60％乙醇，提取时间优选为30min，提取功率优选为250w。

17、进一步的，所述构建方法还包括采用沙棘对照药材加水提取，滤过后将得到的滤液蒸干，加入溶剂提取，混合，固液分离取液体，得到对照药材参照物溶液的步骤，以及按照上述任一所述的构建方法中的超高效液相色谱法检测对照药材参照物溶液得到对照药材参照图谱的步骤。

18、进一步的，沙棘对照药材的质量与水的体积、溶剂的体积比为1.2-1.5g：50-100ml：25-50ml。

19、进一步的，所述沙棘的药物制剂的指纹图谱中具有11个共有峰，峰1为原儿茶酸，峰2为槲皮素-3-o-槐二糖-7-o-鼠李糖苷，峰3为异鼠李素-3-o-槐二糖-7-o-鼠李糖苷，峰4为异鼠李素-3-o-葡萄糖-7-o-鼠李糖苷，峰5为芦丁，峰6为异槲皮苷，峰7为水仙苷，峰8为异鼠李素-3-o-葡萄糖苷，峰9为田基黄苷，峰10为槲皮素，峰11为异鼠李素。

20、进一步的，所述沙棘的药物制剂的指纹图谱共有11个特征峰，峰1与峰7分别于原儿茶酸、水仙苷对照品峰相对应，以水仙苷对照品峰相对应的峰为s2峰，峰2～峰6以及峰8～峰11与s2峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，峰2～峰6和峰8～峰11的规定值依次为：0.50、0.57、0.83、0.85、0.90、1.03、1.11、1.23、1.37。

21、本发明还提供了一种沙棘的药物制剂的含量测试方法，包括如下步骤：

22、(1)供试品溶液的制备；

23、(2)制备原儿茶酸对照品溶液；

24、(3)取供试品溶液采用超高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水或乙腈-含酸的水溶液为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→5min→12min→25min→45min→50min，流动相中乙腈的体积百分数为：4％-5％→5％→15％→18％-22％→45％→45％。

25、进一步的，采用规格为150×2.1mm，1.9μm或150×2.1mm，1.8μm的色谱柱；和/或，含酸的水溶液中的酸选自磷酸、甲酸、乙酸中的至少一种；和/或，含酸的水溶液中酸的体积百分数为0.05-0.1％；和/或，检测波长为215nm-325nm，柱温为25-35℃，流速为0.25-0.35ml/min；和/或，原儿茶酸对照品溶液制备过程中所采用的溶剂选自体积分数为20％以上的甲醇水溶液、20％以上的乙醇水溶液、甲醇、乙醇中的至少一种；和/或，原儿茶酸对照品溶液的浓度为2～600μg/ml。

26、进一步的，梯度洗脱程序优选为：0→5min→12min→25min→45min→50min，流动相中乙腈的体积百分数为：5％→5％→15％→18％→45％→45％。

27、进一步的，所述检测波长优选为260nm，检测柱温优选为30℃，流速优选为0.3ml/min，流动相优选为磷酸水-乙腈，含酸水溶液中酸的体积百分数优选为0.05％。

28、进一步的，所述色谱柱选自于dikma endeavorsil c18、shim-pack gist c18-aq、waters acquity uplc hss t3中的一种，优选为shim-pack gist c18-aq。

29、进一步的，所述供试品溶液的制备方法为：称取供试品，加入溶剂，称定重量后提取，冷却后再次称定重量，用溶剂补足减失的重量，固液分离，取液体，即得；优选的，所述供试品溶液还满足如下a-e中的任意一项或多项：

30、a、供试品溶液的质量与溶剂的体积之比为0.5g-1g：25ml-50ml；

31、b、提取方式为回流提取或超声提取；优选的，所述超声提取的功率为100w-500w；

32、c、提取时间为≥15min，优选为15-45min；

33、d、所述固液分离选自离心或者滤膜过滤；

34、e、溶剂选自体积分数为20％以上的甲醇水溶液、20％以上的乙醇水溶液、甲醇、乙醇中的至少一种。

35、进一步的，所述溶剂优选为60％乙醇，提取时间优选为30min，提取功率优选为250w。

36、本发明还提供了一种沙棘的药物制剂的质量检测方法，包括将待测沙棘产品的指纹图谱与沙棘的药物制剂的对照指纹图谱进行比较的步骤和/或采用上述任一所述的沙棘的药物制剂的含量测试方法测试待测沙棘产品含量的步骤；所述待测沙棘产品的指纹图谱为使用待测沙棘产品按照上述任一所述的构建方法构建得到的，沙棘的药物制剂的对照指纹图谱选自如下a-c中的任意一项：

37、a、其具有11个特征峰，峰1、峰7分别与原儿茶酸、水仙苷对照品峰相对应，以水仙苷对照品峰相对应的峰为s2峰，峰2～峰6与峰8～峰11与s2峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，峰2～峰6和峰8～峰11的规定值依次为：0.50、0.57、0.83、0.85、0.90、1.03、1.11、1.23、1.37；

38、b、使用单批次或者多批次沙棘的药物制剂按照上述任一所述的构建方法得到的沙棘的药物制剂的指纹图谱；

39、c、使用多批次沙棘的药物制剂按照上述任一所述的构建方法得到的指纹图谱通过平均值或者中位数法制成对照指纹图谱。

40、本发明技术方案，具有如下优点：

41、1.本发明提供的一种沙棘的药物制剂的指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：(1)供试品溶液的制备；(2)取供试品溶液采用超高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水或乙腈-含酸的水溶液为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→5min→12min→25min→45min→50min，流动相中乙腈的体积百分数为：4％-5％→5％→15％→18％-22％→45％→45％。本发明通过该方法构建了沙棘的药物制剂的指纹图谱，极大丰富了图谱信息，有效的分离了沙棘的药物制剂中的原儿茶酸、水仙苷、槲皮素-3-o-槐二糖-7-o-鼠李糖苷、异鼠李素-3-o-槐二糖-7-o-鼠李糖苷、异鼠李素-3-o-葡萄糖-7-o-鼠李糖苷、芦丁、异槲皮苷、异鼠李素-3-o-葡萄糖苷、田基黄苷、槲皮素、异鼠李素，指纹图谱基线平稳，峰形好，可以为沙棘的药物制剂的质量控制提供依据。

42、2.本发明提供的沙棘的药物制剂的含量测试方法，包括如下步骤：(1)供试品溶液的制备；(2)制备原儿茶酸对照品溶液；(3)取供试品溶液采用超高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-含酸的水溶液为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→5min→12min→25min→45min→50min，流动相中乙腈的体积百分数为：4％-5％→5％→15％→18％-22％→45％→45％。通过该方法可以测试沙棘的药物制剂中各成分的含量，沙棘中各成分的分离度好，而且构建的方法精密度较高、稳定性和重复性较好，能够全面、快速地检测沙棘的药物制剂中有效成分及其含量。

43、3.本发明提供的沙棘的药物制剂的指纹图谱共有11个特征峰，峰1、峰7分别与原儿茶酸、水仙苷对照品峰相对应，以水仙苷对照品峰相对应的峰为s2峰，峰2～峰6以及峰8～峰11与s2峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，峰2～峰6和峰8～峰11的规定值依次为：0.50、0.57、0.83、0.85、0.90、1.03、1.11、1.23、1.37。通过选择水仙苷峰为s2峰，作为指纹图谱中的内参考峰，可以确定沙棘配方颗粒的11个共有特征峰，并根据s2峰计算出各个共有特征峰的相对保留时间，有利于沙棘配方颗粒的全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定均一性。

44、4.本发明提供的沙棘的药物制剂的质量检测方法，可以同时构建待测沙棘的指纹图谱，并进行含量测定，方法简单，便于对沙棘的质量进行全面控制。