伊贝母中5种物质的分离方法、特征图谱及构建方法与流程

本发明具体涉及一种伊贝母中5种物质的分离方法、特征图谱及构建方法。

背景技术：

1、伊贝母作为新疆名贵道地药材之一，主要分布在伊犁河流域，是百合科贝母属新疆贝母fritillaria walujewii regel或伊犁贝母fritillaria pallidiflora schrenk的干燥鳞茎。伊贝母性微寒、味苦、归肺、心经。在临床当中，常被用来治疗咳痰带血、肺热燥咳等病症，是中医药生产以及中药处方当中常用的药材。伊贝母含有生物碱类、皂苷类、多糖类、香豆素类、淀粉类、黄酮类等多种成分。其中对药用活性成分异甾体生物碱类的研究较为深入，具有清热润肺、化痰止咳、平喘、解痉、抑菌、抗氧化等药理作用。

2、中药饮片标准汤剂作为提升中药配方颗粒的重要桥梁，能确保临床用药准确，剂量一致。中药标准汤剂质量标准将定量和定性两个方面结合在一起，定量主要由指标成分的含量和转移率，出膏率，ph和相对密度等参数组成；定性则是从最能反映总体成分情况的hplc-elsd特征图谱和薄层色谱鉴别入手。现有的文献对伊贝母的研究主要集中在药材以及人工培育等方面，对其标准汤剂研究未见相关报道，因此形成标准汤剂质量评价体系不仅有助于保障用药安全与疗效，还有助于中药饮片，配方颗粒与经典名方等的继承与研究。

3、特征图谱作为整体上对某药物进行质量控制比起单一组分甚至多组分定性定量方法更加明显。然而目前文献中尚未见到关于伊贝母特征图谱的研究报道。因此，为了更好的监控伊贝母中各成分含量，本领域迫切需要建立简单、方便的伊贝母的特征图谱。同时对更有效地控制伊贝母的质量，全面客观评价伊贝母具有重大的意义。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是克服了现有技术中缺乏对伊贝母片标准汤剂研究的缺陷，提供了一种伊贝母中5种物质的分离方法、特征图谱及构建方法。

2、本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。

3、本发明提供了一种伊贝母中5种物质的分离方法，其包括下述步骤：将供试品溶液进行高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测，分离待测组分，即可；

4、其中，所述待测组分包括：贝母辛、西贝母碱苷、伊贝碱苷a、西贝母碱和梭砂贝母碱；

5、所述供试品溶液的制备方法包括下述步骤：s1采用氨水溶液对伊贝母标准汤剂或伊贝母饮片进行生物碱的提取，得混合液；s2将所述混合液和混合溶剂加热回流制得所述供试品溶液；

6、流动相a为浓度0.1-0.5％的三乙胺水溶液，流动相b为乙腈和三乙胺的混合溶液；所述流动相b中，乙腈和三乙胺的体积比为(99.50-99.90)：(0.10-0.50)；

7、所述流动相a和所述流动相b的梯度洗脱条件为：0-20min，35％→42％流动相b；20-40min，42％→64％流动相b；40-50min，64→90％流动相b；50-55min，90％→35％流动相b。

8、本发明中，所述流动相a优选为浓度0.2-0.3％三乙胺水溶液，例如0.25％三乙胺水溶液。

9、本发明中，所述流动相b中，乙腈和三乙胺的体积比优选为99.75：(0.20-0.30)，例如99.75：0.25。

10、本发明中，“0-20min，35％→42％流动相b”一般是指在0-20min范围内，流动相的体积比例由35％逐渐变化为42％。

11、本发明中，色谱柱优选为zafex supfex aq-c18色谱柱。

12、其中，所述zafex supfex aq-c18色谱柱的规格可为4.6mm×150mm，5μm。

13、本发明中，柱温优选为25-40℃，例如30℃或35℃。

14、本发明中，所述供试品溶液的流速优选为0.6-1.5ml/min，更优选为1ml/min。

15、本发明中，进样体积优选为15-25μl，更优选为20μl。

16、本发明中，所述蒸发光散射检测器参数优选为：漂移管温度102℃，气体流速3.0l/min，增益值2。

17、本发明一优选实施例中，所述高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测条件可为：色谱柱为zafex supfex aq-c18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相a为浓度0.25％三乙胺水溶液，流动相b为乙腈：三乙胺(体积比99.75:0.25)；梯度洗脱(0-20min，35％→42％b；20-40min，42％→64％b；40-50min，64→90％b；50-55min，90％→35％b)；柱温30℃；流速1ml/min；elsd检测器：漂移管温度102℃，气体流速3.0l/min，增益值2；进样量20μl。

18、本发明中，一般还配置混合对照品溶液。所述混合对照品溶液的制备方法一般包括下述步骤：精密称取贝母辛、西贝母碱苷、伊贝碱苷a、西贝母碱与梭砂贝母碱对照品适量，加甲醇制成每1ml各含200μg的混合对照品溶液。

19、本发明中，所述的高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测方法优选包括下述步骤：

20、s11分别配置混合对照品溶液和所述供试品溶液，采用上述检测方法对所述混合对照品溶液和所述供试品溶液进行分析检测，分别获得所述混合对照品溶液和所述供试品溶液的高效液相色谱图；

21、s12根据所述混合对照品溶液的高效液相色谱图，确定所述供试品溶液的高效液相色谱图中的各峰对应的化合物，获得测得所述混合对照品溶液和所述供试品溶液中对应化合物的峰面积。

22、s11中，所述混合对照品溶液的配制可采用能将其溶解的常规溶剂，例如甲醇。

23、s11中，所述混合对照品溶液的浓度可为本领域常规，可为30-500μg/ml，例如200μg/ml。

24、所述供试品溶液的制备方法中，s1中，所述伊贝母标准汤剂的制备方法可为本领域常规。

25、一优选实施例中，所述伊贝母标准汤剂的制备方法可包括下述步骤：取干燥的伊贝母饮片200g置于3l电控温陶瓷自动中药煲，加水煎煮两次，第一次煎煮加入7倍量的水，浸泡1h，加热煮沸后煎煮40min，200目滤布趁热滤过，挤压滤布至无明显滤液渗出，第二次加6倍量的水，加热煮沸后煎煮30min，200目滤布趁热滤过，合并2次滤液，滤液转移至圆底烧瓶中，低温减压浓缩至500ml，即得。

26、所述供试品溶液的制备方法中，s1中，所述伊贝母标准汤剂的出膏率优选为6.06％-10.12％，例如6.06％、6.43％、6.44％、6.75％、7.41％、7.56％、7.58％、7.63％、7.76％、8.00％、8.48％、8.96％、9.02％、9.23％或10.12％。

27、所述供试品溶液的制备方法中，s1中，所述伊贝母标准汤剂的平均出膏率优选为7.83％。

28、所述供试品溶液的制备方法中，s1中，所述伊贝母标准汤剂的ph值优选为4.70-6.38，例如4.70、5.53、5.55、5.96、6.13、6.14、6.19、6.23、6.24、6.26、6.27、6.29、6.35、6.36或者6.38。

29、所述供试品溶液的制备方法中，s1中，所述伊贝母标准汤剂的相对密度值优选为1.014-1.024，例如1.014、1.015、1.016、1.018、1.019、1.021、1.024或者1.022。

30、所述供试品溶液的制备方法中，s1中，所述氨水溶液和所述伊贝母标准汤剂的体积质量比可为(2-10)ml：(5.0-10.0)g，例如2ml：7.5g、4ml：7.5g、6ml：7.5g、8ml：5.0g、8ml：7.5g或8ml：10g。

31、所述供试品溶液的制备方法中，s1中，所述氨水溶液和所述伊贝母饮片的体积质量比可为(2-10)ml：3.0g，例如2ml：3.0g、4ml：3.0g、6ml：3.0g或8ml：3.0g。

32、所述供试品溶液的制备方法中，s1中，所述氨水溶液一般是指未稀释、纯的氨水。

33、所述供试品溶液的制备方法中，s1中，所述提取的方法可为本领域常规，一般为将所述伊贝母标准汤剂或所述伊贝母饮片在所述氨水溶液中静置即可。

34、其中，所述静置的时间可为0.3-2.5h，例如0.5h、1h或2h。

35、所述供试品溶液的制备方法中，s2中，所述混合溶剂的种类可为卤代烷和醇溶剂的混合溶液。

36、其中，所述卤代烷优选为二氯甲烷三氯甲烷。

37、其中，所述醇溶剂优选为甲醇。

38、其中，所述卤代烷和醇溶剂的体积比优选为(3.5-4.5)：1，例如4:1。

39、一优选实施例中，混合溶剂可为二氯甲烷-甲醇(体积比为4:1)或三氯甲烷-甲醇(体积比为4:1)。

40、所述供试品溶液的制备方法中，s2中，所述伊贝母标准汤剂和所述混合溶剂质量体积比可为7.5g：(15-65)ml，例如7.5g：20ml、7.5g：40ml或7.5g：60ml。

41、所述供试品溶液的制备方法中，s2中，所述伊贝母饮片和所述混合溶剂质量体积比可为3.0g：(15-65)ml，例如3.0g：20ml、3.0g：40ml或3.0g：60ml。

42、所述供试品溶液的制备方法中，s2中，所述加热回流的温度优选为45-85℃，例如50℃、60℃、80℃。

43、所述供试品溶液的制备方法中，s2中，所述加热回流的时间优选为0.3-3.5h，例如0.5h、1h、2h或3h。

44、本发明中，一般将步骤s2所得产品进行冷却。

45、所述供试品溶液的制备方法中，步骤s2之后，优选地，还进行以下步骤：

46、s3采用s2中所述混合溶剂对s2所得产品进一步溶解(以补足加热回流减失的重量)，得第二混合液；

47、s4所述第二混合液进行一次过滤，所得滤液，去除溶剂，再用甲醇溶剂溶解，二次过滤，得待测样品。

48、s4中，所述一次过滤的方式可为本领域常规，一般采用滤纸去除肉眼可见杂质即可。

49、s4中，所述二次过滤的方式可为本领域常规。例如可采用有机微孔滤膜进行过滤，优选采用孔径为0.22μm或0.45μm的有机微孔滤膜进行过滤。根据本领域常识，所述的过滤为微滤。

50、s4中，所述醇溶剂可为甲醇。

51、s4中，所述待测样品的体积可为去除溶剂前所取滤液体积的0.25-0.75倍，例如0.5倍。

52、本发明一优选实施例中，以三氯甲烷与甲醇(体积比4:1)的混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤纸滤过，精密量取续滤液10ml，减压浓缩至干，残渣加甲醇溶解并定容于5ml量瓶内，摇匀后，0.45μm的有机微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

53、本发明一优选实施例中，所述供试品溶液的制备方法包括下述步骤：

54、伊贝母标准汤剂7.5g或伊贝母饮片3.0g中，加入氨水(未稀释)8ml，静置0.5h，加入二氯甲烷-甲醇(体积比4:1)混合溶液20ml，混合均匀后，置60℃水浴上加热回流2h，冷却后过滤，滤液减压浓缩至干，残渣加入甲醇溶解，并定容于5ml容量瓶内，摇匀，0.45μm的有机微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

55、本发明还提供了一种伊贝母的特征图谱，所述特征图谱中包括5个共有特征峰，以3号峰为对照峰，共有特征峰的相对保留时间分别为：

56、2号共有特征峰为贝母辛，相对保留时间为0.610，rsd为0.12％；

57、3号共有特征峰为西贝母碱苷，相对保留时间为1.000，rsd为0.00％；

58、4号共有特征峰为伊贝碱苷a，相对保留时间为1.490，rsd为0.12％；

59、6号共有特征峰为西贝母碱，相对保留时间为1.850，rsd为0.18％；

60、7号共有特征峰为梭砂贝母碱，相对保留时间为2.350，rsd为0.16％。本发明中，所述伊贝母的高效液相色谱图中，一般还有1号峰、5号峰；

61、1号峰共有特征相对保留时间为0.200，rsd为0.25％；

62、5号峰共有特征相对保留时间为1.650，rsd为0.14％。

63、本发明还提供了一种所述伊贝母的特征图谱构建方法，其包括下述步骤：利用高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测供试品溶液，将检测结果生成特征图谱即可；

64、所述供试品溶液、所述高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测方法均如前所述。

65、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

66、本发明所用试剂和原料均市售可得。

67、本发明的积极进步效果在于：

68、本发明的分离方法中，峰高变高、峰宽变窄，减少了基线噪音的影响，不仅能够同时有效分离伊贝母中贝母辛、西贝母碱苷、伊贝碱苷a、西贝母碱、梭砂贝母碱，而且分离检测时间较短，可在52min之内出峰。

69、本发明建立的特征图谱中，可分离出7种化合物，通过对照品指认出5种化合物，分别为贝母辛、西贝母碱苷、伊贝碱苷a、西贝母碱、梭砂贝母碱。

70、本发明建立了定性评价伊贝母标准汤剂的质量评价方法，该方法较为系统、简单易行、专属性和重复性良好。饮片与标准汤剂特征图谱相似度高。可用于伊贝母标准汤剂质量控制，并为后续配方颗粒及其他研究提供基础数据支撑。

71、优选实施例中制备得到的15批伊贝母标准汤剂的研究结果可知，不同产地的伊贝母饮片成分差异不大，饮片与标准汤剂的色谱峰个数与保留时间差异小，相似度均>0.99，表明伊贝母饮片标准型汤剂符合伊贝母饮片基本属性，最大限度保留原药材饮片特点，总体均一性较好，质量平稳可控。

72、附图说明

73、图1为第1批次伊贝母饮片显微图。其中，图1a为伊贝母粉末中所含导管，图1b为伊贝母粉末中所含淀粉粒。

74、图2为样品的薄层色谱图。其中，序号1为西贝母碱对照品；序号2为伊贝母(伊犁贝母)对照药材；序号3-17为第1-15批为伊贝母饮片。

75、图3为样品的薄层色谱图，其中，序号1为阴性样品；序号2为西贝母碱对照品；序号3为伊贝母(伊犁贝母)对照药材；序号4-18为第1-15批伊贝母标准汤剂。

76、图4为混合对照品高效液相色谱图。其中，峰2为贝母辛；峰3为西贝母碱苷；峰4为伊贝碱苷a；峰6为西贝母碱；峰7为梭砂贝母碱。

77、图5为伊贝母饮片对照特征图谱(图5d)与15批(s1-s15)伊贝母饮片制备的供试品溶液的hplc叠加图谱(图5e)。

78、图6为伊贝母标准汤剂对照特征图谱(图6f)与15批(s1-s15)伊贝母标准汤剂的hplc叠加图谱(图6g)。