一种单个细胞外囊泡上聚糖的分析方法与流程

本发明涉及生物，尤其是涉及一种单个细胞外囊泡上聚糖的分析方法。

背景技术：

1、细胞外囊泡(extracellular vesicles，evs)是由细胞释放的双层膜结构颗粒的统称，根据分泌机制及物理特性大体可分为外泌体(直径30～150nm)、微囊泡(直径100～1000nm)和凋亡小体(直径50～5000nm)等不同亚型。evs具有稳定且无法复制的封闭囊泡状结构，广泛地存在于血液、尿液、唾液、泪液、乳汁、腹水等多种体液中，能够反映亲源细胞或组织的多重生物信息，在细胞间通讯、免疫调节、血管新生、细胞迁移、癌症的发生发展等多种生理病理过程中起重要作用。基于这些特性，evs已在疾病诊断(如癌症的早期筛查)、药物运输、炎症调节、医疗美容等多个领域展现出广泛的应用前景。

2、evs所具有的广泛的生物学功能及临床应用潜力的物质基础主要在于其内含的生物学分子组分。相关研究表明evs携带丰富的内容物，如蛋白质、脂质、核酸、代谢小分子等。值得注意的是，近来研究揭示，除上述组分，evs上还含有多种结构的糖基化合物，如o-聚糖、n-聚糖和糖脂神经节苷脂等，其参与细胞识别、病毒感染、发育分化、免疫应答等多种生物过程。此外，研究表明evs聚糖还可以作为癌症液体活检诊断标志物，如美国德克萨斯大学安德森癌症中心raghu kalluri团队研究表明血浆evs上的蛋白聚糖glypican-1有潜力作为靶标工具用于胰腺癌的早期诊断和监测；新加坡国立大学邵慧琳团队初步证实了ev聚糖在判断胃癌、结直肠癌患者预后方面的良好应用前景等。然而，要充分挖掘evs聚糖在生理病理过程中的重要作用及临床上的应用潜力，离不开对其进行深度且准确的解析。

3、相关技术中，evs聚糖分析手段多数是从囊泡样品整体层面进行分析，如液相色谱、质谱、凝集素微阵列、酶联免疫吸附测定法，以及新近开发的基于巨磁阻效应的gmr磁学分析方法和基于磁性纳米材料聚糖分析方法，采用这些方法所得信息为囊泡群体的平均信号及综合性特征，这造成了很多微弱但重要的evs聚糖信号(如不同囊泡个体间的聚糖异质性)被掩盖，进而极大的阻碍了evs聚糖的应用。如evs聚糖作为一种新型的生物标志物在癌症液体活检中展现出良好的应用前景，但体液中的evs事实上是不同来源(包括肿瘤组织)evs群体的高度复杂的混合体，尤其是在癌症早期，人体体液中癌细胞来源的evs丰度较低，因此利用这些方法对evs聚糖进行分析时，癌细胞来源evs聚糖信号被大量其他细胞或组织来源的evs聚糖信号所掩盖，从而无法有效识别出癌源evs信号，使得evs聚糖在癌症早期检测中的应用受到极大限制。

4、基于此，亟需开发一种新型evs聚糖的解析方法，以克服相关evs聚糖分析方法所面临的不足，为evs聚糖在诸如癌症液体活检等多方面的应用提供新的技术支撑。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种单个细胞外囊泡上聚糖的分析方法，其相对于整体性分析方法(如常规elisa法)具有更优异的检测灵敏度，能够充分显示不同细胞外囊泡个体间的聚糖信号差异性，实现细胞外囊泡个体间的聚糖表达异质性检测，且该方法检测通量高、通用性好。

2、本发明提供了一种单个细胞外囊泡上聚糖的分析方法，包括以下步骤：

3、步骤s1、利用磁性纳米颗粒捕获待测样品中的单个细胞外囊泡，磁分离，得到磁性纳米颗粒复合体；

4、步骤s2、利用生物素修饰的凝集素对所述磁性纳米颗粒复合体中细胞外囊泡上的聚糖进行亲和标记，然后与荧光素修饰的链霉亲和素结合，得到荧光标记的磁性复合物颗粒；

5、步骤s3、利用荧光显微镜采集所述荧光标记的磁性复合物颗粒的图像数据和荧光信号数据，根据单颗所述荧光标记的磁性复合物颗粒的荧光强度判断所述细胞外囊泡上的聚糖表达程度。

6、根据本发明实施例的分析方法，至少具有如下有益效果：

7、(1)本发明方法以纳米尺寸的磁性颗粒为操纵媒介，样品的制备(ev捕获及荧光标记)在离心管中进行即可，操作简便，无需特殊的实验技能；此外，本发明方法是以磁性纳米颗粒作为ev固定的媒介，只需将样品滴加于盖玻片基底上，依靠磁性纳米颗粒在基底上的黏附将ev固定于观察基底上，无需耗时耗力的基底修饰。

8、(2)本发明方法可重复性好，样品需求量低，样品操作体积可自由调节；且本发明方法是基于纳米尺寸的磁性颗粒进行参照定位，单个拍摄视野中样品颗粒数可高达10000以上，具有检测通量高的优点。

9、(3)本发明方法检测灵敏性高，检测限显著低于整体性分析方法(如传统的elisa法)，对ev聚糖的检出性能更为灵敏，并且由本发明方法所获得的ev聚糖信息更为具体及精细化，能充分体现不同ev颗粒间聚糖特征的异质性。

10、(4)本发明方法的整个操作流程无需特殊实验仪器、装置、试剂，不涉及复杂微流控芯片的制备，检测成本低经济性好。此外，本发明方法的信号采集可以使用常规荧光显微镜，操作简便。

11、在本发明的一些实施方式中，步骤s1中，所述捕获待测样品中的单个细胞外囊泡的具体方法包括：将所述磁性纳米颗粒与待测样品混合，其中所述磁性纳米颗粒的颗粒总量为所述待测样品中细胞外囊泡颗粒总量的10倍及以上。

12、在本发明的一些实施方式中，所述磁性纳米颗粒的颗粒总量为所述待测样品中细胞外囊泡颗粒总量的10～15倍，优选为10～12倍，更优选为10倍。

13、通过调整磁性纳米颗粒的颗粒总量和所述待测样品中细胞外囊泡颗粒总量，能够实现mnp@pda颗粒上所捕获的ev不超过一个，便于后续单个细胞外囊泡的荧光信号检测。

14、在本发明的一些实施方式中，所述磁性纳米颗粒为磁性内核颗粒和功能性外壳组成的核壳结构。

15、在本发明的一些实施方式中，所述磁性内核颗粒包括氧化铁。

16、在本发明的一些实施方式中，所述功能性外壳包括聚多巴胺。

17、在本发明的一些实施方式中，所述磁性纳米颗粒的平均粒径范围为100～300nm。优选为100～200nm，更优选为150nm。

18、当磁性纳米颗粒的粒径过大时，磁性纳米颗粒在水介质中的分散性较差，易产生快速的自然沉降(<5分钟)，严重影响磁性纳米颗粒对于溶液中ev的有效捕获。

19、而当磁性纳米颗粒的粒径过小时，在后续检测过程中不便于常规荧光显微镜对磁性纳米颗粒的有效识别。

20、在本发明的一些实施方式中，所述磁性纳米颗粒为聚多巴胺包覆的磁性纳米颗粒(mnp@pda)。

21、在本发明的一些实施方式中，所述聚多巴胺包覆的磁性纳米颗粒(mnp@pda)的制备方法包括：

22、步骤s11、在溶剂中，将醋酸钠、柠檬酸钠和三氯化铁混合，反应，得到磁性纳米内核颗粒；

23、步骤s12、将所述磁性内核颗粒与浓度为0.05～0.2mg/ml聚多巴胺溶液混合反应，即得。

24、在本发明的一些实施方式中，步骤s11中，所述反应的温度为180～220℃，优选为200℃。

25、在本发明的一些实施方式中，步骤s11中，所述反应的时间为8～12h。

26、在本发明的一些实施方式中，步骤s12中，所述混合反应的时间为2～6h。

27、在本发明的一些实施方式中，步骤s1中，所述待测样本中的细胞外囊泡来源包括细胞或组织分泌。

28、在本发明的一些实施方式中，步骤s1中，所述待测样本中的细胞外囊泡获取方法包括超速冷冻离心法、差速冷冻离心、密度梯度离心、沉淀、超滤、尺寸排阻色谱、免疫分离、切向流分离、低压透析过滤中的至少一种。

29、在本发明的一些实施方式中，步骤s1中，所述待测样本中的细胞外囊泡获取方法为超速冷冻离心，具体为：取待测样本置于8000～12000g离心力条件下离心20～40min后取上清，然后将所述上清在离心力为80000～120000g条件下离心100～150min，即得。

30、在本发明的一些实施方式中，步骤s2中，所述凝集素包括伴刀豆凝集素a、小扁豆凝集素、豌豆凝集素、橙黄网胞盘菌凝集素、荆豆凝集素i、小麦胚芽凝集素、番茄凝集素、马铃薯凝集素、曼陀罗凝集素、琥珀酸小麦胚凝集素、加纳籽凝集素ii、红细胞凝集素、白细胞凝集素、蓖麻凝集素i、刺桐凝集素、木菠萝素凝集素、花生凝集素、双花扁豆凝集素、大豆凝集素、绒毛蚕豆凝集素、加纳籽凝集素i、黑接骨木凝集素中的至少一种。

31、在本发明的一些实施方式中，步骤s2中，所述荧光素包括异硫氰酸酯、罗丹明、四甲基罗丹明、别藻蓝素、多甲藻黄素叶绿素蛋白、藻红蛋白、碘化丙啶、cy3、cy5、cy7中的至少一种。

32、在本发明的一些实施方式中，步骤s3中，所述利用荧光显微镜采集所述荧光标记的磁性复合物颗粒的图像数据和荧光信号数据具体包括：

33、将所述荧光标记的磁性复合物颗粒分散于缓冲溶液中，然后取适量于亲水玻片表面，静置，盖上盖玻片并置于所述荧光显微镜下采集数据即可。

34、在本发明的一些实施方式中，所述亲水玻片的材质包括超白玻璃、石英、硼硅酸盐玻璃中的至少一种；优选地，所述亲水玻片的厚度为0.13～0.22mm。

35、在本发明的一些实施方式中，步骤s3中，所述荧光显微镜包括荧光显微镜、全内反射荧光显微镜中的至少一种。

36、在本发明的一些实施方式中，所述细胞外囊泡包括外泌体、微泡、凋亡小体和癌小体中的至少一种。

37、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。