用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒、肿瘤细胞外泌体的定量检测方法与流程

本发明涉及一种用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒、肿瘤细胞外泌体的定量检测方法，属于电化学生物传感器。

背景技术：

1、电化学传感技术具有高灵敏、响应快、准确度高的优点，在生物检测、环境监控、食品安全等领域得到了广泛的应用。其中，适配体传感器以适配体作为识别元件，能够以高亲和性和特异性识别目标物，相较于抗体具备更好的稳定性、毒性且易于储存。

2、癌症是当今严重威胁人类生命的最主要疾病之一，实现肿瘤的早期诊断对降低癌症患者死亡率具有重要意义。其中，肿瘤标志物是临床中常用于癌症诊断的判断依据之一。外泌体(exosomes)作为近年来新兴的肿瘤标志物，是一种可以经由绝大多数细胞分泌的脂质双层膜囊泡，其直径为30-150nm。外泌体广泛分布于人体的血液、唾液、尿液和脑脊液等多种体液中，携带着衍生细胞的多种物质信息，如蛋白、mrna、脂质等，能够在细胞间进行信息传递，影响细胞的生理状态并反映来源细胞的性质。通过对外泌体进行检测与分析对肿瘤的早期诊断、疗效评价以及预后分析具有重要的研究意义。因此，开发一种能够精准定量外泌体的检测方法是目前的研究热点。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种能够提高外泌体定量检测准确度的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒。

2、本发明的目的还在于提供一种肿瘤细胞外泌体的定量检测方法。

3、为了实现以上目的，本发明的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒所采用的技术方案是：

4、一种用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒，包括外泌体捕获电极；所述外泌体捕获电极包括基底电极、修饰在基底电极上的第一材料以及锚定在第一材料上的靶向第一外泌体特异性标志性蛋白的核酸适配体；所述试剂盒还包括第二材料和靶向第二外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体，或者所述试剂盒还包括由第二材料和靶向第二外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体形成的信号放大探针；所述第一材料、第二材料独立选自第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子或第二化学基团修饰mxene纳米片的中的一种，且第一材料不同于第二材料；所述第一外泌体特异标志性蛋白不同于第二外泌体特异标志性蛋白；所述第一化学基团不同于第二化学基团，且第一化学基团能够在检测外泌体时与第二化学基团反应形成化学键。

5、本发明的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒，外泌体捕获电极以及信号放大探针中的fe3o4纳米粒子和mxene纳米片的大比表面积和高导电性有利于外泌体的捕获和电信号响应的增强。该用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒在捕获和检测外泌体时能够进一步放大传感信号，形成一种双重放大电信号的三明治结构的适配体传感器，实现外泌体高灵敏、高稳定的检测。

6、本发明的电化学传感器在外泌体检测中的检测限可低至43个/μl，检测范围可达102-107个/μl，并且可以通过双蛋白标记实现对4t1、hela、hepg2和a549四种肿瘤细胞的识别。

7、可以理解的是，所述信号放大探针是将靶向第二外泌体特异标志蛋白的核酸适配体锚定在第二材料上形成。

8、进一步地，所述第一材料为第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子，所述第二材料为第二化学基团修饰的mxene纳米片。将第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子作为第一材料，能够以其大比表面积捕获外泌体，尤其采用基底电极为磁性基底电极时，fe3o4纳米粒子能够依靠磁性性直接结合组装于基底电极表面简化组装过程，并减少其后续修饰转移过程中的材料掉落和损耗现象，增大电化学信号，提高灵敏度；将第二化学基团修饰的mxene纳米片作为第二材料，能够依靠其优良地电化学性能放大电化学信号，实现更为灵敏的检测。

9、进一步地，所述第一化学基团为氨基或羧基，所述第二化学基团为氨基或羧基，且第一化学基团与第二化学基团不同。

10、进一步地，所述基底电极为磁性基底电极。以第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子作为第一材料时，fe3o4纳米粒子的磁性吸附作用可以直接实现其与基底电极的直接连接，增大捕获效率并提高传感器的检测性能。所述磁性基底电极优选为磁性玻碳电极。

11、所述第一外泌体特异标志性蛋白为cd63蛋白；第二外泌体特异标志性蛋白为epcam蛋白。分别以cd63蛋白和epcam蛋白作为第一外泌体特异标志性蛋白和第二外泌体特异标志性蛋白的原因在于cd63蛋白和epcam蛋白作为普遍在各类外泌体表面表达的蛋白被广泛应用在外泌体于适配体的特异性连接之中。

12、进一步地，所述第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子为氨基化修饰的fe3o4纳米粒子。所述靶向第一外泌体特异标志性蛋白(即cd63蛋白)的核酸适配体为5′-cooh-ttttttcaccccacctcgctcccgtgacactaatgcta。氨基化修饰的fe3o4纳米粒子通过锚定靶向cd63蛋白适配体后作为纳米捕获探针，可以与外泌体连接，起到捕获外泌体和电信号放大的作用。

13、所述基底电极为磁性基底电极，第一材料为第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子时，进一步地，所述的外泌体捕获电极的制备方法，包括以下步骤：将磁性基底电极浸没于第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子溶液中与靶向第一外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体溶液孵育一段时间后，混入edc/nhs混合溶液进行孵育。所述第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子溶液的浓度为1-2mg/ml。所述靶向第一外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体溶液的浓度为1-1.5μmol/l。所述第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子溶液与所述靶向第一外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体溶液的体积之比为1:1-2:1。所述fe3o4纳米粒子溶液中与靶向第一外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体溶液孵育优选时间为30-45min。靶向第一外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体溶液与混入的edc/nhs混合溶液的体积之比为1.5～2.5:1。混入edc/nhs混合溶液后孵育时间为过夜。混入edc/nhs混合溶液后进行孵育的温度为4℃。

14、进一步地，所述edc/nhs混合溶液中edc和nhs的浓度摩尔比例为2:3。所述edc/nhs混合溶液中edc的浓度为0.4mol/l，nhs的浓度为0.6mol/l。

15、进一步地，所述第一化学基团修饰的fe3o4纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：将fe3o4纳米粒子分散在醇类溶剂中加入氨基硅烷偶联剂在75-85℃下进行反应，反应结束后将反应产物进行洗涤、干燥，即得。所述氨基硅烷偶联剂为氨丙基三乙氧基硅烷。加入氨基硅烷偶联剂在75-85℃下进行反应的时间为24-26h，反应在搅拌条件下进行。优选地，加入氨基硅烷偶联剂在80℃下进行反应。每0.2g fe3o4纳米粒子对应采用的氨基硅烷偶联剂的质量为0.4-0.5ml。所述醇类溶剂优选为乙醇，每0.2g fe3o4纳米粒子对应采用的醇类溶剂的体积为90～110ml，例如为100ml。

16、所述fe3o4纳米粒子的平均粒径为180～220nm，例如为200nm。所述fe3o4纳米粒子可以采用溶剂热法制备。进一步地，所述fe3o4纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：将铁盐在分散剂和乙二醇的混合物中分散均匀，加入醋酸钠和抗坏血酸后在150～250℃反应6～12h，对反应所得固体进行洗涤，即得。所述分散剂优选为聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐。聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐和乙二醇的混合物中，每0.55g聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐对应采用的乙二醇的体积为18～22ml，例如为20ml。所述铁盐为三氯化铁，每0.54g三氯化铁，对应采用的混合物中聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐的质量为0.5-0.55g，对应采用的醋酸钠的质量为1.5-1.55mg，对应采用的抗坏血酸的质量为8-10mg。进一步地，加入醋酸钠和抗坏血酸后进行的反应的温度为200℃，时间为10h。

17、可以理解的是，mxene纳米片即二维过渡金属碳化物纳米片、二维过渡金属氮化物纳米片或二维过渡金属碳氮化物。进一步地，所述第二化学基团修饰的mxene纳米片为第二化学基团修饰的ti3c2tx mxene纳米片。进一步地，所述第二化学基团修饰的mxene纳米片为羧基化修饰的mxene纳米片。所述靶向第二外泌体特异标志性蛋白(即epcam蛋白)的核酸适配体为5′–nh2–ttttttcactacagaggttgcgtctgtcccacgttgtcatggggggttggcctg。羧基化修饰的mxene材料上连接靶向epcam蛋白的适配体作为信号放大器被捕获在电极表面，可以提高电极电化学性能，放大电信号。

18、进一步地，所述羧基化修饰的mxene纳米片是将分层mxene纳米片悬浮液加入到氨基酸溶液中进行反应后干燥得到。加入氨基酸溶液进行的反应在搅拌条件下进行，反应的温度为室温，反应的时间为24h-26h。所述分层mxene纳米片悬浮液的浓度为1-2.5mg/ml；加入的分层mxene纳米片悬浮液中分层mxene纳米片与氨基酸溶液中氨基酸的质量之比为1:1-2:1。所述氨基酸溶液为甘氨酸溶液。所述氨基酸溶液是将氨基酸溶解在水中形成，每10mg氨基酸对应采用的水的体积为10-20ml。

19、进一步地，所述分层mxene纳米片悬浮液为mxene单层纳米片悬浮液。所述mxene单层纳米片悬浮液的获取方法包括以下步骤：将多层ti3c2tx mxene粉末分散在水中进行超声处理后，再进行离心处理，获取上清液，得到ti3c2tx mxene单层纳米片悬浮液。所述超声处理的时间为2-4h；所述离心处理的转速为3500-5000rpm，时间为1-2h。

20、所述多层ti3c2tx mxene粉末可以采用现有技术进行制备，例如所述多层ti3c2txmxene粉末采用包括以下步骤的方法制得：将ti3alc2 max原料加入混合溶液中在40-50℃下反应24-26h，然后将反应产物清洗至中性，干燥即得。所述混合溶液是将氟化锂溶解在盐酸中得到。所述盐酸的浓度为9-12mol/l，每1.6g氟化锂对应采用的盐酸的体积为18～22ml，例如为20ml。每1g ti3alc2 max原料对应采用的混合溶液中氟化锂的质量为1.6-1.7g。所述清洗为离心清洗，离心清洗的离心速率为3000～4000rpm。将反应产物清洗至中性后进行的干燥为真空干燥，真空干燥的温度为45～55℃。

21、进一步地，所述试剂盒还包括edc/nhs混合溶液。该edc/nhs混合溶液中edc的浓度为0.4mol/l，nhs的浓度为0.6mol/l。

22、本发明的肿瘤细胞外泌体的定量检测方法所采用的技术方案为：

23、一种肿瘤细胞外泌体的定量检测方法，包括以下步骤：采用上述的用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒的外泌体捕获电极从肿瘤细胞外泌体提取液中捕获外泌体，得到复合电极；然后将得到复合电极与所述用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒的第二材料、靶向第二外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体孵育后进行电化学测试，或将得到的复合电极吸附所述用于肿瘤细胞外泌体检测的试剂盒的信号放大探针后进行电化学测试。

24、本发明的肿瘤细胞外泌体的定量检测方法，在检测外泌体的过程中构建的fe3o4-nh2-靶向第一外泌体特异性标志性蛋白的核酸适配体/外泌体/mxene-cooh-靶向第二外泌体特异性标志性蛋白的核酸适配体的“三明治”结构的生物传感器实现外泌体的精准定量检测。

25、进一步地，将复合电极与试剂盒的第二材料、靶向第二外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体进行孵育的方法，包括以下步骤：将复合电极浸没于第二外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体溶液中孵育一定时间后，加入第二材料分散液，然后混入edc/nhs混合溶液后继续进行孵育。所述靶向第二外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体溶液的浓度为1-1.5μmol/l。所述第二材料分散液中第二材料的浓度为0.1～2mg/ml，例如为1mg/ml；将复合电极浸没在第二外泌体特异标志性蛋白的核酸适配体溶液中进行孵育的时间优选为60-120min。edc/nhs混合溶液中edc的浓度为0.4mol/l，nhs的浓度为0.6mol/l。edc/nhs混合溶液的作用是活化第二材料所修饰的羧基。加入第二材料分散液后，混入edc/nhs混合溶液后进行过夜孵育，混入edc/nhs混合溶液后进行孵育的温度为4℃。

26、进一步地，所述电化学测试获取待测外泌体提取液的差分脉冲伏安法响应曲线。

27、本发明的肿瘤细胞外泌体的定量检测方法，还包括以下步骤：构建外泌体溶液浓度与电化学测试获取的外泌体溶液的差分脉冲法响应曲线峰值电流之间的函数关系，然后利用所述函数关系，根据电化学测试获取的待测外泌体提取液的差分脉冲伏安法响应曲线的峰值电流，计算待测外泌体溶液的浓度。可以理解的是，获取待测外泌体提取液的差分脉冲伏安法曲线与建立所述函数关系时电化学测试获取外泌体溶液的差分脉冲法响应曲线的电化学测试条件相同。所述电化学测试的电位扫描范围为-0.2v～0.6v，扫描速率为50mv/s。所述电化学测试采用的三电极体系。