一种肿瘤组织HER2梯度检测产品的制备方法和应用与流程

本发明涉及生物病理检测领域，尤其是涉及一种肿瘤组织her2梯度检测产品的制备方法和应用，尤其涉及到肿瘤组织her2梯度检测产品在检测her2个体化半定量病理的应用。

背景技术：

1、随着基础研究和临床医学的迅速发展，越来越多的参与肿瘤发生、发展和影响预后的分子标志物被相继发现。生物标志物通常是指能被客观测量和评价，反映生理或病理过程，以及对暴露或治疗干预措施产生生物学效应的指标。生物标志物多来源于人体组织或体液，可涵盖生理、生化、免疫、细胞和分子等水平的改变。在肿瘤领域，生物标志物通常是由肿瘤细胞或非肿瘤细胞产生的、反映体内肿瘤细胞或非肿瘤细胞存在和变化的生物学物质，这是生物标志物的物质性。生物标志物还有它的计量性，即它是可以计量的。这种计量的变化紧密地与人体的生理条件，疾病发生和发展，健康状态等相关。可包括基因变异、蛋白受体异常表达或血液成分的变化等。因此，生物标志物的检测可广泛地应用于病人的筛查、诊断、临床研究、指导用药、预后等领域。

2、生物标志物的种类繁多，涵盖生理、生化、免疫、细胞和分子等水平的改变，其临床价值各不相同，例如her2，约20-30%的乳腺癌患者存在her2基因的扩增和蛋白质过表达。her2阳性乳腺癌具有恶性程度高、易复发、易转移等特点，因此her2是乳腺癌病理亚型和预后性生物标志物，也是抗 her2单克隆抗体的预测性生物标志物。

3、大量的研究已经证实了her2阳性对于肿瘤患者具有重要的临床价值，近年来也提出了“her2低表达”的概念，即ihc 1+或ihc 2+/ish-，s.modi等公布了enhertu（trastuzumab deruxtecan）的关键3期destiny-breast04试验（nct03734029）的详细阳性结果显示：在先前接受过治疗的her2低表达、不可切除性和/或转移性乳腺癌患者中，enhertu治疗使其无进展生存期（pfs）和总生存期（os）取得了统计学显著和临床意义的改善，说明her2低表达的准确识别对于肿瘤精准治疗具有重要作用。因此，明确her2状态具有极其重要的临床意义，相关检测的使用率、准确率也受到了高度重视。

4、现有her2检测试剂盒/her2四合一病理质控片多采用细胞系作为对照样本，主要是her2不同表达水平的细胞团，但对照样本的生物学特征一致性不稳定，样本来源受限，通常难以追溯样本来源和实现可持续供应。细胞系来源的对照样本仅为肿瘤细胞，非肿瘤组织，因而缺失肿瘤组织的微环境，不能体现真实的组织结构。更重要的是，临床上进行免疫组化染色的待测样本为肿瘤组织，并非肿瘤细胞，利用细胞系来源的对照无法区分非特异性染色。现有分子标志物检测的对照样本和待检样本分别贴附于不同的玻片表面，免疫组化染色条件和过程不同步，对照阅片过程中需要更换玻片和显微镜重新对焦，操作繁琐，且染色结果由病理医师主观阅片判读，而不同病理医师对于免疫组化染色强度的判断尺度，存在主观上的异质性，如果是由实验系统误差导致的免疫组化染色强度有所增减，临床病理医师在阅片判读时更是无从识别。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种肿瘤组织her2梯度检测产品的制备方法和应用，尤其涉及到肿瘤组织her2梯度检测产品在检测her2个体化半定量病理的应用。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一目的，本发明提供了一种肿瘤组织her2梯度检测产品的制备方法，包括以下步骤：

4、1）根据her2对应的全基因组测序（wes）基因拷贝数变异信息及rna-seq蛋白表达特征，通过pdx/pdtx肿瘤活组织数据库中存储的样本不同基因拷贝数变异信息及蛋白表达情况初步筛选出符合特征要求的pdx/pdtx肿瘤活组织样本；

5、2）将步骤1）获得的pdx/pdtx肿瘤活组织样本进行取样，获得组织块，固定组织块，制得蜡块，将所述蜡块进行病理检测，首先进行he染色，剔除掉肿瘤细胞比例＜30%及坏死比例＞20%的样本；然后进行ihc染色，在显微镜下观察pdx/pdtx肿瘤活组织样本的her2表达水平是否符合筛选要求，最后进行fish检测，根据her2对应的fish信息特征筛选her2免疫组化染色梯度为0、1+、2+、3+的最优的pdx/pdtx肿瘤活组织样本；

6、3）利用pdx/pdtx技术对步骤2）获得的her2不同染色梯度的肿瘤组织样本进行建模复苏和扩增，获得扩增的肿瘤组织，进行病理复测和fish复测，确定最优的her2不同染色梯度0、1+、2+、3+的pdx/pdtx肿瘤活组织样本；

7、4）用组织芯片阵列仪分别取不同her2表达的组织柱，放入预铸蜡块，制备受体蜡块；

8、5）将步骤4）制得的受体蜡块进行连续切片，将切片贴于打印好标签的粘附性载玻片上的染色对照区，由上至下分别是her2染色梯度为0、her2染色梯度为1+、her2染色梯度为2+及her2染色梯度为3+的组织切片，自然晾干，制得肿瘤组织her2梯度检测产品。

9、本发明肿瘤组织her2梯度检测产品的制备方法具备统一的质控标准，染色质量稳定；制成的检测产品密封后可以常温长期保存；对照pdx/pdtx肿瘤活组织来源充足，可持续生产供应；在检测过程中与待测组织同步进行免疫组化染色，方便病理医师阅片，更易甄别染色强度的差异。本发明检测产品制作过程标准化，耗时少且减少了人力，大大减轻了临床工作人员的工作量。

10、作为本发明所述肿瘤组织her2梯度检测产品的制备方法的优选实施方式，her2染色梯度为0的pdx/pdtx肿瘤活组织样本对应的基因拷贝数变异为1~2；her2染色梯度为1+的pdx/pdtx肿瘤活组织样本对应的基因拷贝数变异为1~4；her2染色梯度为2+的pdx/pdtx肿瘤活组织样本对应的基因拷贝数变异为1~30；her2染色梯度为3+的pdx/pdtx肿瘤活组织样本对应的基因拷贝数变异大于30。

11、即：

12、

13、her2染色梯度为0的pdx/pdtx肿瘤活组织样本对应的rna-seq 的tpm归一化值在0~4之间；her2染色梯度为1+的pdx/pdtx肿瘤活组织样本对应的rna-seq 的tpm归一化值4~8之间；her2染色梯度为2+的pdx/pdtx肿瘤活组织样本对应的rna-seq 的tpm归一化值在8~50之间；her2染色梯度为3+的pdx/pdtx肿瘤活组织样本对应的rna-seq 的tpm归一化值为大于50。

14、即：

15、

16、her2染色梯度为0的pdx/pdtx肿瘤活组织样本对应的fish信息特征中的her2/cep17 *比值为～1.20；

17、her2染色梯度为1+的pdx/pdtx肿瘤活组织样本对应的fish信息特征中的her2/cep17 *比值为～1.24；

18、her2染色梯度为2+的pdx/pdtx肿瘤活组织样本对应的fish信息特征中的her2/cep17 *比值为～7.00；

19、her2染色梯度为3+的pdx/pdtx肿瘤活组织样本对应的fish信息特征中的her2/cep17 *比值为～20.0。

20、作为本发明所述肿瘤组织her2梯度检测产品的制备方法的优选实施方式，所述步骤2）中将所述蜡块进行fish检测，包括以下步骤：

21、a）将所述蜡块切片、烤片、脱蜡、复水、水处理、洗涤、蛋白酶k处理、洗涤和脱水，获得组织切片；

22、b）取双色探针，滴于步骤a）获得的组织切片的杂交区域进行变性杂交，然后复染，观察her2不同染色梯度pdx/pdtx肿瘤活组织样本的fish检测结果。

23、作为本发明所述肿瘤组织her2梯度检测产品的制备方法的优选实施方式，所述变性的温度为83℃，变性的时间为5min；所述杂交的温度为42℃，所述杂交的时间为2~16h。

24、作为本发明所述肿瘤组织her2梯度检测产品的制备方法的优选实施方式，所述步骤5）中待测组织样本与所述染色对照区的pdx/pdtx肿瘤活组织样本同步染色。

25、对照pdx/pdtx肿瘤活组织与待测组织同步染色，为组织之间进行比对，可以识别出特异性染色和非特异性染色，病理医师可以根据组织形态学特点准确定位，与背景对比，辅助诊断阅片。

26、作为本发明所述肿瘤组织her2梯度检测产品的制备方法的优选实施方式，所述步骤3）中，建模复苏和扩增的具体步骤包括：对步骤2）获得的her2不同染色梯度的pdx/pdtx肿瘤活组织样本剪切，接种至小鼠，待p0代的小鼠的移植肿瘤生长体积累积至500~2000mm3，解剖取出并剪切接种至p1代的小鼠，待p1代的小鼠的移植肿瘤生长体积累积至500~2000mm3，解剖取出作为备选对照区样本。

27、pdx/pdtx异种移植技术已被国内外公认为最理想的模拟人源肿瘤的药效学检测模型，pdx/pdtx技术直接将患者手术切除或活检的原代肿瘤组织移植到小鼠体内，肿瘤组织扩增后进行药效检测。移植的肿瘤组织包含肿瘤细胞、基质、成纤维细胞和微血管，完整保留了原始肿瘤的三维结构、异质性及肿瘤微环境，是目前最理想的模拟人源肿瘤的药效检测模型。本发明通过pdx/pdtx技术构建肿瘤活组织数据库，将her2稳定表达（包括0、1+、2+、3+）的肿瘤活组织样本进行石蜡包埋并用于制备检测产品，阴性/阳性对照组织来源质量可靠，且可持续生产供应。

28、本发明通过人源性肿瘤组织异种移植（pdx/pdtx，patient derived xenograft/patient derived tumor xenograft）技术将从真实病人取材的肿瘤组织制成石蜡切片，染色结果与真实病人组织无异。检测产品为真实病人不同程度her2表达的肿瘤样本接种小鼠后生成的异种移植瘤石蜡组织切片。

29、对照pdx/pdtx肿瘤活组织样本来源充足，可持续生产供应，因取材于pdx/pdtx肿瘤活组织数据库中存储的pdx/pdtx肿瘤活样本，方便获取其her2表达情况，可以迅速筛选出合适的pdx/pdtx肿瘤活组织制作出相应的对照组织切片。

30、作为本发明所述肿瘤组织her2梯度检测产品的制备方法的优选实施方式，所述步骤3）中，ihc染色包括烤片、脱蜡和水化、抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色、复染和封片。

31、作为本发明所述免疫组化染色梯度检测产品的制备方法的优选实施方式，所组织样本的大小为1.5cm×1.5cm×0.5cm。

32、每个对照组织点体积小，库存蜡块的损耗少；染色对照区的组织面积小，与待测组织之间有清楚的界限，不影响待测组织的染色。

33、本发明还提供了上述制备方法制备得到的肿瘤组织her2梯度检测产品，所述肿瘤组织her2梯度检测产品基于pdx/pdtx肿瘤活组织生物样本库和数据库。

34、本发明还提供了上述肿瘤组织her2梯度检测产品在检测her2个体化半定量病理的应用。

35、作为本发明所述应用的优选实施方式，取出肿瘤组织her2梯度检测产品，将待测组织切片后，贴片于肿瘤组织her2梯度检测产品的组织贴片区，然后对待测组织进行染色，对照染色对照区的染色结果进行待测组织的结果判读。

36、本发明肿瘤组织her2梯度检测产品上对照区的组织取材于肿瘤活组织生物样本库中的pdx/pdtx肿瘤组织，即利用人源肿瘤异种移植（patient derived xenograft/patient derived tumor xenograft，pdx/pdtx）技术——将病人的肿瘤组织移植到免疫缺陷的小鼠身上进行扩增传代而获得的肿瘤组织。国外已有大量研究证实了pdx/pdtx肿瘤组织能够很好地保留原代肿瘤组织包括组织病理特征、肿瘤微环境、基因组学信息等在内的生物学特征。本发明同样验证了pdx/pdtx肿瘤活组织生物样本库中存储的原代肿瘤和pdx/pdtx肿瘤组织的生物学特征一致性、基因组学一致性和组织病理学一致性。

37、本发明基于普恩瑞自建的pdx/pdtx肿瘤活组织生物样本库和数据库，并利用基因拷贝数变异（copy number variations，cnv）和转录组测序技术（rna-seq）等分子技术，以及he染色、ihc染色、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，fish）等病理技术，制备标准化、质量稳定可靠、可持续供应的以pdx/pdtx肿瘤活组织样本为对照的肿瘤组织her2梯度检测产品，填补了国内外相关领域的空白，该产品可辅助分子标志物表达结果的精准判读，减小不同医院、不同医生之间的主观判读误差，可进一步提高her2识别判读的特异性及准确度。

38、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述待测组织切片的厚度为4μm。

39、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述产品包括试剂盒或质控片。

40、本发明提供了一种肿瘤组织her2梯度检测产品的制备方法和应用，本发明通过pdx/pdtx技术构建肿瘤活组织数据库，将her2稳定表达（包括0、1+、2+、3+）的pdx/pdtx肿瘤活组织样本进行石蜡包埋并用于制备检测产品，阴性/阳性对照组织来源质量可靠，且可持续生产供应。用于染色对照区的组织样本均通过基因拷贝数变异、荧光原位杂交初步筛选，再由he染色、免疫组织化学染色确定，并且最终经过荧光原位杂交验证，质控标准统一。对照pdx/pdtx肿瘤活组织可真实展示组织结构，能够区分出待测组织样本的特异性和非特异性染色，很好地展示抗体的特异性及灵敏度，在病理判读方面可以提供更多的信息，不仅可用于监控免疫组化实验过程，还可以辅助判读病理结果，具有十分重要的临床应用价值；对照组织来源和性状稳定，染色质量稳定，可以长期保存；在检测过程中对照组织与待测组织同步进行免疫组化染色，本产品可根据染色强度和定位判断免疫组织化学实验流程中是否出现失误导致染色结果不可信，同时还拥有形态学特征，将对病理医师最终结果的判读有积极的参考和对比意义。