高效液相色谱法检测氨磷汀中间体纯度及其有关物质的方法与流程

本发明属于药物分析检测领域，具体涉及一种高效液相色谱法检测氨磷汀中间体纯度及其有关物质的方法。

背景技术：

1、氨磷汀(amifostine)，clinigen公司开发的有机硫化磷酸化合物细胞保护剂，在组织中被碱性磷酸酶水解脱磷酸后，代谢为含巯基的活性代谢物(h2n-(ch2)3-nh-(ch2)2-sh)，因巯基具有清除组织中的自由基的作用，故能降低顺铂、环磷酰胺及丝裂霉素等的毒性。氨磷汀是一种广谱的正常细胞保护剂，主要用于各种癌症的辅助治疗。减轻化疗引起的肾脏、骨髓、心脏、耳及神经系统的毒性，及放疗前使用可显著减少口腔干燥和粘膜炎的发生。

2、现有技术公开的氨磷汀合成方法中，通常采用n-(2-溴乙基)-1,3-丙二胺二氢溴酸盐(简称m2)作为氨磷汀合成过程中的重要中间体，其分子式c5h15br3n2，分子量342.90，化学结构如下式：

3、

4、由于中间体m2是合成氨磷汀产品的前一步骤，因此中间体m2的纯度、杂质直接影响氨磷汀的质量，从而也直接影响该药物的安全性和疗效。因此，在中间体m2工艺过程中监控中间体m2纯度和其杂质的含量对氨磷汀质量的控制具有非常重要的作用。

5、在氨磷汀的合成过程中，其中间体m2可能会存在关键的副反应产物、反应原料残留的杂质。氨磷汀中间体m2合成过程中控制的有关物质有三个，分别如下：

6、中间体m1，n-(2-羟乙基)-1,3-丙二胺二氢溴酸盐，反应原料残留的杂质，化学结构如下式：

7、

8、高哌嗪，1,4-二氮环庚烷，副反应产物，化学结构如下式：

9、

10、m2-a，n,n-二(2-溴乙基)-1,3-丙二胺二氢溴酸盐，副反应产物，化学结构如下式：

11、

12、对于上述提到的杂质，特别是m2-a杂质，其结构含有卤代烷烃结构，为警示结构，因此m2-a为潜在基因毒性杂质。根据ich m7指导原则规定，杂质含有警示结构、与原料药结构无关以及无致突变性数据，判断为3类致突变杂质，则该类杂质的含量控制在可接受的限度以下(合适的ttc，其中ttc是指开发毒理学关注阈值，用以确定所有未经研究的化学物质的无致癌性或其他毒性作用的风险的可接受的摄入量)。

13、由于氨磷汀适用于治疗卵巢癌、头颈癌放疗、非小细胞肺癌，治疗周期均小于10年，因此根据ich m7指导原则的要求，氨磷汀用药在10年以内，杂质的ttc可接受摄入量为10μg/天。原研说明书中规定的用药量为910mg/m2，结合欧洲药典中的细菌内毒素指导原则，最大人体皮肤表面积为1.8m2，计算得出api最大日剂量为1.638g/day。则m2-a在氨磷汀中的安全限度为(10μg/天)/(1.638g/天)＝6ppm。

14、经检索，目前还没有一种分离上述已知杂质检测方法的报道，但有文献(2014年大连理工大学硕士学位论文“氨磷汀及其中间体新分析方法研究”)报道采用色谱柱为phenomenex luna c18(4.6mm×250mm，5μm)，以甲醇-0.94g/l己烷磺酸钠水溶液(磷酸调ph值至2.5)为40：60，二极管阵列检测器，检测波长为220nm，流速为1ml/min，进样量为10μl的反向高效液相色谱条件，建立了中间体m2的分析方法。本发明人尝试采用上述的色谱条件，且对流动相甲醇-0.94g/l己烷磺酸钠水溶液(磷酸调ph值至2.5)比例调整为5：95，对中间体m2的纯度和其有关物质进行检测，发现仅有一个出峰时间，经分析，m2-a与m2结构相似，其游离态均没有紫外吸收的官能团，推测是溴离子的出峰时间，发明人在对比例1证实了上述表明的结果，因此说明文献实际是通过检测中间体m2中溴离子含量，然后根据溴离子含量间接计算m2含量的方法，该方法并不适用于中间体m2纯度和其有关物质的检测。

15、因此，现迫切需要一种不仅可以快速、简单且准确地检测中间体m2的纯度，而且能够检测中间体m2中基因毒性杂质m2-a以及其它有关物质含量的方法。

技术实现思路

1、本发明第一个目的在于提供一种快速、准确地检测中间体m2的纯度的方法。

2、本发明第二个目的在于提供一种可以监控中间体m2中基因毒性杂质m2-a含量的方法，从而可以提示中间体m2化合物可能存在安全风险，需要在中间体工艺过程中有效地控制基因毒性杂质m2-a的含量，进而能够保证基因毒性杂质m2-a在终产品氨磷汀中的残留符合质量要求。

3、本发明第三个目的在于提供一种不仅可以检测中间体m2中基因毒性杂质m2-a含量，而且可以同时检测其它多种未知和/或已知有关物质含量的方法。

4、为实现上述目的，本发明提供了一种高效液相色谱法测定氨磷汀中间体n-(2-溴乙基)-1,3-丙二胺二氢溴酸盐纯度以及其有关物质的检测方法，所述高效液相色谱法采用未键合的硅胶颗粒为填充剂的色谱柱，流动相a为乙腈，流动相b为50±5mmol/l甲酸铵溶液且用甲酸调ph值至2.2±0.1，将流动相a和b按一定比例进行梯度洗脱；

5、进一步，本发明所述梯度洗脱比例为：0～2min，80％ a；2～30min，80％→50％a；30～30.1min，50％→80％a；30.1～35min，80％a；

6、进一步，本发明所述色谱柱为waters altantis hilic slica，规格：4.6mm×250mm×5μm；

7、进一步，本发明所述流动相b为50mmol/l甲酸铵溶液且用甲酸调ph值至2.2。

8、进一步，本发明所述流动相的流速为0.8～1.2ml/min，优选1ml/min；

9、进一步，本发明所述高效液相色谱法的进样量10～20μl，优选10μl；

10、进一步，本发明所述高效液相色谱法的柱温为30～40℃，优选35℃；

11、进一步，本发明所述高效液相色谱法的检测器为cad；

12、更进一步，本发明所述的高效液相色谱法的具体色谱条件是：用waters altantishilic slica，规格4.6mm×250mm，5μm的色谱柱；以乙腈为流动相a，50mmol/l甲酸铵溶液(用甲酸调ph值至2.2)为流动相b；流速为1ml/min；检测器为cad；柱温为35℃；进样体积10μl，梯度洗脱程序为：0～2min，80％a；2～30min，80％→50％a；30～30.1min，50％→80％a；30.1～35min，80％a；

13、进一步，本发明所述有关物质为n-(2-羟乙基)-1,3-丙二胺二氢溴酸盐、n,n-二(2-溴乙基)-1,3-丙二胺二氢溴酸盐和高哌嗪的一种或多种；

14、进一步，本发明还包括供试品溶液的配制，具体配制为：称取氨磷汀中间体适量，置于量瓶中，用溶剂溶解并稀释成每1ml中含有氨磷汀中间体约5mg的溶液；

15、进一步，本发明所述溶剂是体积比为80:20的流动相a与b的混合溶液；

16、进一步，本发明所述检测方法用于检测氨磷汀中间体的纯度；

17、进一步，本发明所述检测方法用于检测氨磷汀中间体中基因毒性杂质以及其它未知和/或已知杂质的含量。

18、本发明还提供了一种化合物，具有式(i)所示结构:

19、

20、进一步，本发明还提供的式(i)所示化合物在氨磷汀或其中间体n-(2-溴乙基)-1,3-丙二胺二氢溴酸盐的有关物质检测中作为标准品或对照品的用途。

21、根据本发明的一些具体实施方式，所述检测方法包括如下步骤：

22、(1)空白溶液/溶剂/稀释剂：体积比为80:20的流动相a与流动相b的混合溶液；

23、(2)定位溶液：称取适量m1杂质样品，置10ml量瓶中，加入(1)配制的溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得m1杂质定位溶液；称取适量m2-a杂质样品，置10ml量瓶中，加入(1)配制的溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得m2-a杂质定位溶液；

24、(3)供试品溶液：称取氨磷汀中间体m2适量，置于量瓶中，用(1)配制的溶剂溶解并稀释成每1ml中含有氨磷汀中间体约5mg的溶液；

25、(4)设置色谱条件：用waters altantis hilic slica，规格4.6mm×250mm，5μm的色谱柱；以乙腈为流动相a，50mmol/l甲酸铵溶液(用甲酸调ph值至2.2)为流动相b；流速为1ml/min；检测器为cad；柱温为35℃；进样体积10μl，梯度洗脱程序为：0～2min，80％a；2～30min，80％→50％a；30～30.1min，50％→80％a；30.1～35min，80％a；

26、(5)取步骤(1)、(2)和(3)的溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按照面积归一化法计算氨磷汀中间体m2纯度和其有关物质的含量。

27、本发明具有下述有益效果：

28、本发明提供了一种氨磷汀中间体m2的检测方法，不仅可以有效地分离中间体m2及其有关物质，而且能够对中间体m2的纯度及其有关物质进行定性和定量分析，该方法具有灵敏度高、重复性、专属性及耐用性良好的优点。

29、本发明提供的检测方法能够快速、准确地检测氨磷汀中间体m2中的基因毒性杂质m2-a的含量，从而能够提示中间体m2化合物可能存在安全风险，为进一步的杂质安全性评价和控制指明方向。

30、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

31、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。