桃红四物汤的UPLC-Q-TOF-MS分析方法及应用与流程

本发明涉及药物检测，尤其涉及一种桃红四物汤的uplc-q-tof-ms分析方法及应用。

背景技术：

1、桃红四物汤，是由燀山桃仁、酒红花、酒白芍、酒当归、川芎及酒地黄构成的的活血补气之方，出自于清代柴得华所著《妇科冰鉴》，是《古代经典名方目录(第一批)》收载的方剂。中医临床将该方用于血虚兼血瘀证，及经期超前、血多有块、色紫稠粘、腹痛等妇科疾病的治疗，广泛用于各种血瘀、血虚之证，同时对于中医治疗的优势病种如心脑血管疾病、妇产科疾病、骨科疾病等均有较好的疗效，因此将该方剂开发为中药经典名方复方制剂具有较好的临床价值和应用前景。

2、目前，中药质量评价标准存在科学性差、质量追溯性差、质量均一性差等问题，已成为制约行业发展的重中之重。而经典名方复方制剂研发过程中，首先需要开展“物质基准”质量研究。“经典名方物质基准”是指以古代医籍中记载的经典名方制备方法为依据制备而得的中药药用物质的标准，除成型工艺外，其余制备方法应当与古籍记载基本一致。经典名方复方制剂的所有药学研究均须与物质基准进行对比，以确保与物质基准的关键质量属性一致。由此可见，建立以关键质量属性辨识和量值传递为核心的质量控制体系，是高品质经典名方复方制剂的研发核心。

3、桃红四物汤中成分复杂，且各成分间相互干扰，较难分离检出。目前虽有部分关于桃红四物汤的研究，但现有的关于桃红四物汤的检查分析手段，能够分析的成分种类较少且相对片面，无法全面分析桃红四物汤中的主要成分。因此，对于桃红四物汤中还含有哪些主要成分，还有待进一步研究。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供一种桃红四物汤的uplc-q-tof-ms分析方法及应用。

2、为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

3、一种桃红四物汤的uplc-q-tof-ms分析方法，所述分析方法是采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用技术对桃红四物汤中的成分进行表征；

4、所述超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用技术采用乙腈作为流动相a，浓度为0.08～0.12wt％的甲酸水溶液作为流动相b；

5、洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的洗脱条件为：

6、0～5.50min，15％→20％流动相a，85％→80％流动相b；

7、5.50～8.50min，20％→40％流动相a，80％→60％流动相b；

8、8.50～17.00min，40％→65％流动相a，60％→35％流动相b。

9、进一步的，所述分析方法还包括：

10、以燀山桃仁、酒红花、酒白芍、酒当归、川芎及酒地黄作为单味药样品，采用相同的色谱条件和质谱条件对进行表征，以确定桃红四物汤中各成分对应的中药来源。

11、进一步的，所述分析方法也包括：

12、以芍药苷、洋川芎内酯i、咖啡酸和阿魏酸作为对照品，采用相同的色谱条件和质谱条件对进行表征，以确定桃红四物汤中各成分对应的成分种类。

13、进一步的，所述超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用技术的质谱检测分别在正、负离子模式下进行，干燥气温度为348～352℃，干燥气流速为9～11l/min，雾化气压力为34～36psi，鞘气温度为348～352℃，鞘气流速为11～13l/min，正模式下毛细管电压为3900～4100v，负模式下毛细管电压为3400～3600v。

14、进一步的，所述超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用技术的一级质谱选用ms模式，质量扫描范围100～1000m/z。

15、进一步的，所述超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用技术的二级质谱选用auto-ms/ms模式，碰撞电压分别10v、20v和30v。

16、进一步的，所述超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用技术的色谱条件为：色谱柱为ultimate uhplc xb-c18色谱柱；流速为0.3～0.5ml/min；柱温为25～30℃；检测波长为240nm。

17、进一步的，所述分析方法具体包括以下步骤：

18、取桃红四物汤，制备供试品溶液；

19、分别取燀山桃仁、酒红花、酒白芍、酒当归、川芎及酒地黄，制备相应的各单味药样品溶液；

20、取芍药苷、洋川芎内酯i、咖啡酸和阿魏酸，制备对照品溶液；

21、分别取供试品溶液、各单味药样品溶液和对照品溶液进行超高效液相色谱串联质谱检测，分析，确定桃红四物汤中所含成分种类及各成分对应的中药来源；

22、所述分析是通过对检测供试品溶液所得供试品的色谱结果和质谱结果与检测各单味药样品溶液所得各单味药的色谱结果和质谱结果及检测对照品溶液所得对照品的色谱结果和质谱结果分别比对分析，并通过与文献数据比对分析，确定桃红四物汤中所含成分种类及各成分对应的中药来源；

23、所述分析还可以是通过对检测供试品溶液所得供试品的色谱结果和质谱结果与本发明表1中记载的信息进行比对分析，确定桃红四物汤中所含成分种类及各成分对应的中药来源；

24、色谱结果是uplc-uv色谱结果，即经超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱检测所得色谱图或者色谱图中的信息；色谱图中的信息包括色谱峰的峰号及对应的保留时间等信息；

25、质谱结果是是uplc-ms正、负模式下的总离子流结果，即经超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱检测所得正、负模式下的总离子流图，或者正、负模式下的总离子流图中的信息；正、负模式下的总离子流图中的信息包括一级正、负模式下加合离子、二级正或负模式下特征碎片离子、测得分子量、理论分子量等信息。

26、进一步的，所述供试品溶液是取桃红四物汤加水溶解后，经乙酸乙酯提取，分相，所得乙酸乙酯液蒸干后，利用甲醇溶解后制得；

27、各单味药样品溶液是分别取燀山桃仁、酒红花、酒白芍、酒当归、川芎及酒地黄分别加水煎煮后，所得相应的滤液经乙酸乙酯提取，分相，所得相应的乙酸乙酯液蒸干后，利用甲醇溶解后制得。

28、利用上述分析方法获得的桃红四物汤中成分的表征结果在桃红四物汤的研究/开发/生产/临床应用全过程质量评价或控制中的应用，所述成分的表征结果是在桃红四物汤中共分离、检出的40个色谱峰并指认38个色谱峰，分别为：1号峰为没食子酸、2号峰为5-羟甲基糠醛、3号峰为对羟基苯甲酸、4号峰为咖啡酸、5号峰为芍药内酯苷、6号峰为野黑樱苷、7号峰为芍药苷、8号峰为牡丹皮苷i、9号峰为香豆酸、10号峰为6-hydroxykaempferol-3-o-β-d-glucoside、11号峰为3-hydroxy-4，5，6，7-tetrahydro-6，7-dihydroxy-3-butylphthalide、12号峰为阿魏酸、13号峰为地黄紫罗兰苷a、14号峰为6-o-galloylalbiflorin、15号峰为没食子酰芍药苷、16号峰为毛蕊花糖苷、17号峰为洋川芎内酯j、18号峰为kaempferol-3-o-β-rutinoside、19号峰为chuanxiongnolide r1、20号峰为洋川芎内酯i、21号峰为芍药新苷、22号峰为洋川芎内酯h、23号峰为草蒿脑、24号峰为2z-decaene-4，6-diyn-1-o-z-d-glucopyranoside、25号峰为n(1)，n(5)，n(10)-(z)-tri-p-coumaroylspermidine、26号峰为n(1)，n(5)，n(10)-(e)-tri-p-coumaroylspermidine、27号峰为safflospermidine a、28号峰为苯甲酰芍药苷、29号峰为白芍苷r3、30号峰为阿魏酸松柏醇酯、31号峰为川芎内酯a、32号峰为洋川芎内酯f、33号峰为洋川芎内酯g、36号峰为洋川芎内酯b、37号峰为洋川芎内酯a、38号峰为e-藁本内酯、39号峰为z-藁本内酯、40号峰为chuanxiongnolide l2；

29、所述成分的表征结果即为桃红四物汤中所含成分种类及各成分对应的中药来源。

30、本发明的桃红四物汤的uplc-q-tof-ms分析方法及应用的有益效果为：

31、本发明通过调整洗脱程序，成功将桃红四物汤中40种成分有效分离并检出，尤其是针对桃红四物汤中目前并无法一次性分离检出的没食子酸、5-羟甲基糠醛、野黑樱苷、6-hydroxykaempferol-3-o-β-d-glucoside、3-hydroxy-4，5，6，7-tetrahydro-6，7-dihydroxy-3-butylphthalide、地黄紫罗兰苷a、6-o-galloylalbiflorin、洋川芎内酯j、kaempferol-3-o-β-rutinoside、chuanxiongnolide r1、洋川芎内酯i、洋川芎内酯h、草蒿脑、2z-decaene-4，6-diyn-1-o-z-d-glucopyranoside、n(1)，n(5)，n(10)-(z)-tri-p-coumaroylspermidine、n(1)，n(5)，n(10)-(e)-tri-p-coumaroylspermidine、safflospermidine a、苯甲酰芍药苷、白芍苷r3、阿魏酸松柏醇酯、川芎内酯a、洋川芎内酯f、洋川芎内酯g、洋川芎内酯b、e-藁本内酯、z-藁本内酯和chuanxiongnolide l2等成分；本发明的分析方法能够通过一次进样成功将这些成分成功分离、检出并定性，为桃红四物汤的研究提供更为充足的科学依据；

32、本发明通过调整色谱条件和质谱条件，采uplc-q-tof-ms对桃红四物汤进行检测分析，能够有效将桃红四物汤中40种成分分离、检出，并对其中38种成分进行定性；

33、本发明采用uplc-q-tof-ms分析方法，显著提高了检测效率，一次性利用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱检测分析，即可成功分析出桃红四物汤中的40种化学成分，并指认38种成分，通过本发明对40种成分(包括指认的38种成分)作为检测指标，更有利于桃红四物汤的药理活性和安全性的判断；

34、本发明采用uplc-q-tof-ms分析方法，效率高、速度快，能够得到准确的分子结构信息，可以获得各个化合物的一级和多级质谱信息，为桃红四物汤中多指标成分分析提供了良好的技术手段，具有超高的灵敏度和优异的定性能力；

35、本发明中分析的桃红四物汤中的40种化学成分存在细微结构差异，产生的质谱特征片段存在较大差异，可准确确证活性成分；

36、本发明采用uplc-q-tof-ms分析方法，只需在仪器上完成质谱图库的构建，后续分析过程中可无需对照品，只需检测样品，将样品测试结果与质谱图库比较，即可确证样品中是否含有目标活性成分；

37、本发明的桃红四物汤的uplc-q-tof-ms分析方法适用于各类桃红四物汤制剂的活性成分检测，进而判断桃红四物汤的药理活性；

38、本发明的桃红四物汤的uplc-q-tof-ms分析方法，方法简单、准确度高、稳定性好、重复性良好、活性成分分离效果好，可作为桃红四物汤药理活性检查的重要方法。