一种基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的电化学适配体传感器及其应用的制作方法

本发明属于生物分子检测，具体涉及一种基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的电化学适配体传感器及其应用。

背景技术：

1、邻近分析的概念是fredriksson等在《自然生物技术》上发表的文章中首次提出的，可以体外分析蛋白质和其他大分子，分析原理是采用两个亲和配体同时结合同一个目标分子，两个亲和配体在空间上被拉近，形成的一对邻近探针局部浓度急剧增加，从而促进随后的反应发生。正是由于需要两个亲和配体同时结合造就了该方法具备很好的特异性。科学家们将邻位分析与pcr信号放大检测方法相结合，开发了一系列的具有极高的灵敏度和特异性的传感器，广泛应用于细胞因子、肿瘤标志物、酶和病原体等多方面的检测。

2、电化学生物传感器(electrochemical biosensor)是一类以电极作为体系中的信号灯的转换器，生物中的活性单元为成分(例如：抗原、抗体、酶、微生物或者整个细胞)作为待测物识别原件并以电流、电导或电势变化作为特征检测信号的利用化学反应原理，把有机物质或者无机物质所含的浓度、组成成分等，转换为电信号的一种传感器。电化学生物传感器具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，在致病菌、重金属、农兽药残留等领域受到了广泛关注和研究，在食品安全检测、医学、生物学等领域表现出极大的应用潜力。但是现有的电化学生物传感器类型较少，因此，开发一种新型的用于检测蛋白的电化学生物传感器具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的电化学适配体传感器及其应用。本发明所述传感器信噪比高，对于低浓度或高浓度的蛋白都能准确的进行检测，用途广泛，制备方法简单，具有重要的应用价值。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的电化学适配体传感器，所述电化学适配体传感器包括自组装在金电极上的三嵌段多腺嘌呤dna探针、目标蛋白临近探针和生物素标记的抗体；

4、所述三嵌段多腺嘌呤dna探针包括polya序列和连接在polya序列两侧的侧翼序列，包括第一侧翼序列和第二侧翼序列；

5、所述目标蛋白临近探针包括目标蛋白临近探针a和目标蛋白临近探针b；

6、所述生物素标记的抗体为识别目标蛋白的抗体。

7、本发明设计了一种三嵌段多腺嘌呤dna探针(三嵌段polya dna探针)：无需特别化学修饰，中间的polya序列与金共价结合就能够实现捕获探针在金电极表面的紧凑和有序组装，两端侧翼序列通过一个相同的polya序列相连接，形成间距可控的单分子1:1比例探针电化学自组装界面(sam)。采用邻近结合诱导杂交策略，两端侧翼序列分别设计成短链探针，将目标蛋白临近探针(aptamer a和aptamer b)的尾部分别设计与三嵌段polyadna探针的侧翼互补的延伸序列，且单个延伸序列与polya dna探针的单个侧翼的熔炼温度较低，只有当目标蛋白存在时，aptamer a和aptamer b同时结合到目标蛋白上，临近效应促进aptamer a和aptamer b尾部延伸序列分别与两端侧翼的短链探针杂交，形成稳定的复合结构。生物素化的针对待测蛋白的抗体可以和待测蛋白特异性结合，并通过生物素-链霉素之间牢固的结合力将辣根过氧化酶捕获到金电极表面，辣根过氧化酶与底物发生反应产生电化学信号，通过检测催化氧化还原电流变化指示目标蛋白的浓度。

8、优选地，所述侧翼序列由侧翼连接序列和侧翼互补序列组成。

9、优选地，所述侧翼连接序列为(t)n，其中n为整数，n选自8-12，例如可以是8、9、10、11或12。

10、优选地，所述侧翼互补序列的碱基数为6-10个碱基，例如可以是6、7、8、9或10。

11、优选地，所述目标蛋白临近探针由延伸连接序列、蛋白识别序列、延伸互补序列组成。

12、优选地，所述延伸连接序列为(t)n，其中n为整数，n选自35-45，例如可以是35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45等。

13、优选地，所述延伸互补序列的碱基数为6-10个碱基，例如可以是6、7、8、9或10。

14、优选地，所述第一侧翼序列由侧翼连接序列和侧翼互补序列1组成；所述目标蛋白临近探针a由延伸连接序列、蛋白识别序列a、延伸互补序列1组成；其中，侧翼互补序列1与目标蛋白临近探针a的延伸互补序列1互补配对。

15、优选地，所述第二侧翼序列由侧翼连接序列和侧翼互补序列2组成；所述目标蛋白临近探针b由延伸连接序列、蛋白识别序列b、延伸互补序列2组成；其中，侧翼互补序列2与目标蛋白临近探针b的延伸互补序列2互补配对。

16、优选地，所述polya序列的碱基数为8-40，优选为10-20。

17、优选地，所述电化学适配体传感器还包括链霉素修饰的辣根过氧化酶。

18、第二方面，本发明提供一种基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的检测方法，所述检测方法包括：

19、构建第一方面所述的基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的电化学适配体传感器；建立电化学电流信号与目标蛋白的浓度之间的线性回归方程；通过检测待测样品的电化学电流信号指示测待测样品中目标蛋白的浓度。

20、优选地，步骤(1)中，所述传感器采用包括如下步骤的方法构建得到：

21、(1)三嵌段polya捕获探针在金电极表面组装：将经过物理打磨的金电极进行电化学清洗，将三嵌段polya捕获探针溶液滴加到金电极表面进行恒温反应组装；

22、(2)金电极表面封闭：采用封闭试剂封闭处理组装后的金电极；

23、(3)将目标蛋白临近探针、待测溶液混合后加在封闭后的金电极上，恒温孵育；再依次加生物素标记的抗体和链霉素修饰的辣根过氧化酶。

24、优选地，步骤(1)中，所述电化学清洗在硫酸溶液中进行，所述硫酸溶液的浓度为0.02-1μm，例如可以是0.02μm、0.08μm、0.1μm、0.2μm、0.4μm、0.6μm、0.8μm或1μm等。

25、优选地，步骤(1)中，所述三嵌段polya捕获探针溶液中三嵌段polya捕获探针的浓度为0.01-3μm，例如可以是0.01μm、0.1μm、0.5μm、0.8μm、1μm、1.5μm、2μm或3μm等，溶剂为te组装缓冲液，ph 6.8-7.2，例如可以是6.8、7.0或7.2等。

26、优选地，步骤(1)中，所述反应组装的时间为8-12小时，例如可以是8、10或12等；所述反应组装的温度为20-25℃，例如可以是20℃、22℃或25℃等。

27、优选地，步骤(2)中，所述封闭试剂为质量浓度为0.5-1.5％的酪蛋白溶液，例如可以是0.5％、1％或1.5％等；所述酪蛋白溶液的溶剂为pbs缓冲液，ph7.0-7.4，例如可以是7.0、7.2或7.4等。

28、优选地，步骤(2)中，所述封闭处理的时间为25-35分钟，例如可以是25、30或35等；所述封闭处理的温度为20-25℃，例如可以是20℃、22℃或25℃等。

29、优选地，步骤(3)中，将所述目标蛋白临近探针置于pbs缓冲液中，在89-95℃(例如可以是89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃等)变性4-5分钟(例如可以是4或5等)再冷却至20-25℃(例如可以是20℃、22℃或25℃等)。

30、优选地，步骤(3)中，所述目标蛋白临近探针与待测溶液孵育时，所述目标蛋白临近探针的终浓度为20-80nm，例如可以是20nm、50nm或80nm等。

31、优选地，步骤(3)中，所述恒温孵育的温度为35-39℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃或39℃等；所述恒温孵育的时间为1.5-2.5小时，例如可以是1.5、2或2.5等。

32、优选地，步骤(3)中，所述生物素标记的抗体的浓度为0.5-2μg/ml，例如可以是0.5μg/ml、1μg/ml或2μg/ml等。

33、优选地，步骤(3)中，加生物素标记的抗体后在20-25℃(例如可以是20℃、22℃或25℃等)反应0.5-1.5小时(例如可以是0.5、1或1.5等)；加链霉素修饰的辣根过氧化酶后在20-25℃(例如可以是20℃、22℃或25℃等)反应10-15分钟(例如可以是10、13或15等)。

34、第三方面，本发明提供一种基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的检测试剂盒，所述检测试剂盒中包括第一方面所述的基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的电化学适配体传感器。

35、第四方面，本发明提供第一方面所述的基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的电化学适配体传感器和/或第三方面所述的基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的检测试剂盒在蛋白定量检测中的应用。

36、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

37、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

38、在三嵌段多腺嘌呤dna探针的中间加入polya嵌段在邻近结合诱导杂交测量过程中发挥着重要作用：

39、(1)本发明可以规避传统末端修饰dna探针的常见间距控制困难的问题，通过调节polya的碱基数来实现临近反应的间距控制，保证了对目标pdgf-bb的高灵敏检测。

40、(2)两个侧翼探针通过polya嵌段连接，可以在分子层面上严格1:1的关系，有利于邻近结合诱导杂交反应的产生。

41、(3)本发明具有高度的特异性，虽然同源的pdgf-ab与pdgf-bb具有相同的靶点，但是由于该发明不能通过一个临近探针有效捕获pdgf-ab，所以可以很好的区分同源的pdgf-ab与pdgf-bb。