一种检测禽呼肠孤病毒抗体的间接ELISA方法及其专用试剂盒

本技术具体涉及一种检测禽呼肠孤病毒抗体的间接elisa方法及其专用试剂盒。

背景技术：

1、鸡病毒性关节炎(aviandviralarthritis)是由禽呼肠孤病毒(avianreovirus，arv)引起的鸡、鸭、鹅、火鸡和多种禽类的急性、高度接触性传染病。

2、arv感染禽类后，可导致病毒性关节炎/腱鞘炎、吸收不良综合征、骨质疏松、蓝翼病、发育迟缓综合征、肠道疾病、呼吸道疾病、神经系统疾病和免疫抑制等一系列综合性临床症状，甚至导致死亡，给养禽业带来严重的经济损失，是危害养鸡业的主要疾病之一。

3、禽呼肠孤病毒主要以水平传播方式为主，也可经蛋垂直传播或趾部皮肤破损感染。此外，由于arv可长期定殖于感染家禽的盲肠扁桃体和跗跖关节，带毒鸡成为潜在感染源。因此，禽呼肠孤复杂的传播方式和存在持续感染的特性使得实际生产中很难根除arv感染，给本病防控带来极大得困难。目前对于arv的防控，主要采用接种弱毒疫苗的方式，且产生较好的效果。但弱毒苗存在一些问题，如毒力返强、疫苗毒株所诱导的免疫抑制影响其他疫苗的免疫效果及增加宿主对其他病原的易感性，因次迫切需要制定安全有效的免疫程序，其中监测疫苗免疫后抗体水平的高低尤为重要。elisa检测方法以其敏感、特异、操作方便而被广泛应用于临床检测。该法适合于基层兽医部门和鸡场对该病的诊断和和疫苗免疫后抗体水平的监测。目前，已有国内外生产的商品化禽呼肠孤病毒抗体检测试剂盒，但其存在非特异性反应和异种间较大的交叉反应下。因此迫切需要研制出敏感性和特异性均高的禽呼肠孤病毒检测试剂盒，减轻禽呼肠孤病毒感染的防控工作。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何高敏感性和/或高特异性地检测禽呼肠孤病毒。

2、为了解决上手度问题，本发明提供了下述应用。

3、蛋白质在下述任一中的应用：

4、a1)蛋白质在制备用于检测禽呼肠孤病毒产品中的应用；

5、a2)蛋白质在制备用于诊断或辅助诊断禽呼肠孤病毒感染所引起的疾病的产品中的应用；

6、a3)蛋白质在制备用于筛查或辅助筛查禽呼肠孤病毒感染所引起的疾病的产品中的应用；

7、a5)蛋白质在制备用于检测禽呼肠孤病毒抗体的产品中的应用；

8、a6)蛋白质在制备用于禽呼肠孤病毒感染所引起疾病的防控产品中的应用；

9、所述蛋白质为下述任一种：

10、b1)氨基酸序列是seq id no.2的蛋白质；

11、b2)氨基酸序列是seq id no.2的第1-326位的的蛋白质；

12、b3)将b1)或b2)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

13、b4)在b1)或b2)的n端和/或c端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质。

14、序列2具体如下：

15、maglnpsqrrevvslilsltsnvnishgdltpiyerltnleastellhrsisdisttvsnisanlqdmthtlddvtanldglrttvtalqdsvsilstnvtdltnrssahaailsslqttvdgnstaisnlksdissnglaitdlqdrvkslestashglsfspplsvadgvvsldmdpyfcsqrvsltsysaeaqlmqfrwmargtngssdtidmtvnahchgrrtdymmsstgnltvtsnvvlltfdlsdithipsdlarlvpsagfqaasfpvdvsftrdsathayqaygvysssrvftitfptggdgtanirsltvrtgidtklatypydvpdyalsawshpqfekgggsgggsggsawshpqfek。

16、上文中，seq id no.2的蛋白质蛋氨基酸的第1-326位为σc蛋白，第341-370位为strepeⅱ标签。

17、上文中，所述禽呼肠孤病毒感染所引起疾病可为鸡病毒性关节炎。

18、上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

19、上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gapexistencecost，perresiduegapcost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

20、上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

21、上述蛋白质中，序列2(seq id no.2)由370个氨基酸残基组成。

22、上述的应用中，所述蛋白质按照包括如下步骤的方法制备：使所述蛋白质的编码基因在昆虫细胞中进行表达得到所述蛋白质。

23、上述的应用中，使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达包括将所述蛋白质的编码基因导入昆虫细胞，得到表达所述蛋白质的重组昆虫细胞，培养所述重组昆虫细胞，表达得到所述蛋白质。

24、上文中，所述昆虫细胞可为sf9细胞。

25、上文中，所述蛋白质的编码基因可为序列表中的序列1第1-978位所示。

26、上文中，所述蛋白质的编码基因可为序列表中的序列1所示。

27、上文中，编码基因通过表达载体导入昆虫细胞。

28、上文中，所述表达载体可为pfastbac载体。

29、所述编码基因与表达载体重组后重组载体可为pfastbac-strepⅱ-σc供体重组质粒。

30、所述pfastbac-strepⅱ-σc供体重组质粒用dna片段1(seq id no.1)替换pfastbac载体的限制性核酸内切酶sacⅰ和xbai酶识别位点之间的片段，保持pfastbac载体的其它核苷酸序列不变，得到的重组质粒。

31、为了解决上手度问题，本发明提供了下述应用。

32、与上述蛋白质相关的生物材料的应用，其所述应用为下述任一种：

33、c1)蛋白质在制备用于检测禽呼肠孤病毒产品中的应用；

34、c2)蛋白质在制备用于诊断或辅助诊断禽呼肠孤病毒感染所引起的疾病的产品中的应用；

35、c3)蛋白质在制备用于筛查或辅助筛查禽呼肠孤病毒感染所引起的疾病的产品中的应用；

36、c5)蛋白质在制备用于检测禽呼肠孤病毒抗体的产品中的应用；

37、c6)蛋白质在制备用于禽呼肠孤病毒感染所引起疾病的防控产品中的应用；

38、所述生物材料为下述d1)至d5)中的任一种：

39、d1)编码权上述重组蛋白的核酸分子；

40、d2)含有d1)所述核酸分子的表达盒；

41、d3)含有d1)所述核酸分子的重组载体、或含有d2)所述表达盒的重组载体；

42、d4)含有d1)所述核酸分子的重组微生物、或含有d2)所述表达盒的重组微生物、或含有d3)所述重组载体的重组微生物；

43、d5)含有d1)所述核酸分子的重组细胞、或含有d2)所述表达盒的重组细胞、或含有d3)所述重组载体的重组细胞。

44、d1)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质σc的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质σc的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质σc且具有蛋白质σc功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

45、上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

46、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gapexistencecost，perresiduegapcost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

47、上述生物材料中，d2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的dna，该dna不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。

48、作为一个具体实施例，上述所述重组载体为重组质粒bacmid-strepⅱ-σc，所述重组质粒bacmid-strepⅱ-σc是用dna片段1(seq id no.1)替换pfastbac载体的限制性核酸内切酶sacⅰ和xbai酶识别位点之间的片段，保持pfastbac载体的其它核苷酸序列不变，得到的重组质粒。

49、本文中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、人工染色体(如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)、p1人工染色体(pac)或ti质粒人工染色体(tac)等)、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等)。

50、上述d3)中，所述重组载体可为用昆虫表达载体构建含有所述基因表达盒的重组表达载体。作为一个具体实施例，本技术使用pfastbac载体作为表达载体。

51、本文中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(escherichia),欧文氏菌(erwinia),根癌农杆菌属(agrobacterium)、黄杆菌属(flavobacterium),产碱菌属(alcaligenes),假单胞菌属(pseudomonas),芽胞杆菌属(bacillus)等。作为一个具体实施例，微生物可为dh10bac。

52、本文中，所述细胞是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞(如酵母细胞、曲霉菌)、动物细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞)或原核细胞(如大肠杆菌或枯草杆菌)。所述细胞具体可为trans5αchemicallycompetentcell和/或bl(21)de3感受态细胞。作为一个具体实施例，细胞可为sf9细胞。

53、上述的应用中，d1)所述核酸分子为下述任一种：

54、e1)编码序列是seq id no.1所示的dna分子；

55、e2)核苷酸序列是seq id no.1所示的dna分子；

56、e3)编码序列是seq id no.1第1-978位所示的dna分子；

57、e4)核苷酸序列是seq id no.1第1-978位所示的dna分子。

58、上述的应用中，所述重组细胞为将重组质粒bacmid-strepⅱ-σc导入sf9细胞得到的表达氨基酸序列是seq id no.2的蛋白质的重组细胞，所述重组细胞命名重组细胞sf9/bacmid-strepⅱ-σc，所述重组质粒bacmid-strepⅱ-σc是将seq id no.1替换pfastbac载体的限制性核酸内切酶sacⅰ和xbai酶识别位点之间的片段，保持pfastbac载体的其它核苷酸序列不变，得到的重组质粒。

59、为了解决上手度问题，本发明提供了一种用于检测禽呼肠孤病毒的试剂盒。

60、所述试剂盒包括上述的蛋白质。

61、上述的试剂盒中，所述试剂盒还包括5％脱脂乳，所述5％脱脂乳由脱脂乳和pbst组成，脱脂乳的质量含量为5％，其余为pbst。

62、所述pbst为pbst洗涤液。

63、上述述的蛋白质。

64、上述述的生物材料。

65、有益效果

66、禽呼肠孤病毒的σc蛋白作为病毒外核衣壳蛋白中最小的一个蛋白，由s1基因编码，具有诱导病毒中和抗体的产生和疫苗接种后的保护性抗体的功能。因此，可利用σc蛋白作为包被抗原，建立检测禽白血病和鸡白痢抗体的间接elisa检测试剂盒。

67、与原核表达及其他真核表达系统相比，昆虫杆状病毒系统能够高水平的表达外源性蛋白且表达的外源蛋白具有与天然蛋白相似的结构、抗原性及功能活性，因此，本研究基于elisa的基本原理，利用昆虫杆状病毒系统表达的禽呼肠孤病毒外衣壳σc蛋白作为包被抗原，开发出能够特异性性检测禽呼肠孤病毒的elisa试剂盒。通过摸索最佳的σc包被条件，优化elisa的反应条件建立检测禽呼肠孤病毒的间接elisa方法。与目前临床使用的试剂盒相比，本发明的试剂盒具有高敏感性和高特异性，即无交叉反应。该方法既能快速检测临床arv的感染，又能很好的监测疫苗免疫后抗体的水平，达到诊断后及时淘汰和免疫后及时监测的目的，极大地缓解了临床对该疾病的防控压力。