一种检测地美硝唑的试纸条及其制备方法和应用与流程

本发明涉及地美硝唑的检测，具体涉及一种用于检测地美硝唑的胶体金试纸条，其特别适用于禽蛋中地美硝唑残留的检测。

背景技术：

1、地美硝唑是硝基咪唑类药物，对滴虫、原虫病和厌氧菌有良好的预防和治疗作用，同时还具有抗结核、抗病毒、抗病毒肿瘤等作用，常作为兽药用于畜禽类疾病的预防和治疗。但是，地美硝唑作为药物在动物体内会有一定的残留，会引起人体致突变和致癌等副作用，对人体的健康造成影响。

2、目前已报道的检测地美硝唑的方法主要是液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法等仪器方法。这些方法均须在实验室条件下操作，样品前处理繁琐费时，还需配备昂贵的仪器设备，检测成本较高、耗时长、操作复杂，在实际应用过程中有很大的限制性，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。因此，开发一种简单快速、适用于禽蛋中地美硝唑残留的胶体金试纸条，可满足大量样品现场筛选和监控。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有的检测地美硝唑的方法存在的对设备依赖性高，并且不能够实现对大批量样品的快速检测的特点，提供一种操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低、不受检测设备限制的试纸条及其制备方法和应用，以实现对大批量的地美硝唑样品进行快速检测和现场监控。

2、为了实现本发明的目的，本发明提供了一种检测地美硝唑的试纸条，该试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；所述反应膜上具有包被有地美硝唑半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线；所述结合物释放垫上喷涂有地美硝唑单克隆抗体-胶体金标记物。

3、所述地美硝唑单克隆抗体是以地美硝唑半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。

4、所述地美硝唑半抗原-载体蛋白偶联物由地美硝唑半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白；

5、所述地美硝唑半抗原的合成方法为：取1.96g 1-(2-叠氮乙基)-2-甲基-5-硝基-1h-咪唑加20ml n,n-二甲基甲酰胺溶解，加入0.36g无水硫酸铜和0.51g抗坏血酸钠充分搅拌后，加入2.56g炔丙基-琥珀酰亚胺酯微波辐照1min，停止反应；加200ml水充分搅拌，以乙酸乙酯为溶剂萃取三次，每次100ml，合并有机相蒸干，上硅胶柱，用体积比为5:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液洗脱分离，得到地美硝唑半抗原，其分子结构式为：

6、

7、所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。

8、所述底板可为pvc底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

9、本发明还提供了一种制备上述试纸条的方法，其包括以下步骤：

10、1)制备喷涂有地美硝唑单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

11、2)制备具有包被有地美硝唑半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

12、3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。

13、具体地说，步骤包括：

14、1)以1-(2-叠氮乙基)-2-甲基-5-硝基-1h-咪唑为起始原料，与炔丙基-琥珀酰亚胺酯，经叠氮化物与末端炔基加成反应，制备地美硝唑半抗原；

15、2)将地美硝唑半抗原与载体蛋白偶联，制备地美硝唑半抗原-载体蛋白偶联物；

16、3)用地美硝唑半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌地美硝唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

17、4)提取小鼠igg免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

18、5)分别将地美硝唑半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线(t)和质控线(c)上；

19、6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

20、7)将制备的地美硝唑单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到地美硝唑单克隆抗体-胶体金标记物；

21、8)将地美硝唑单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘干2h后取出，置于干燥环境中保存备用；

22、9)将样品吸收垫用含1％牛血清白蛋白、ph为7.2的0.02mol/l磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘干2h备用；

23、10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖。最后切成3.95mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，4～30℃条件下保存12个月。结合物释放垫的1/3被样品吸收垫覆盖可以延长检测结果观察时间，使样品吸收垫将检测液体充分吸收并与金标抗体充分反应，从而减少误差。

24、本发明还提供了一种应用上述试纸条检测样品中地美硝唑残留的方法，它包括以下步骤：

25、(1)样品前处理；

26、(2)用试纸条进行检测；

27、(3)分析检测结果。

28、本发明的地美硝唑快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将地美硝唑单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的地美硝唑在流动过程中与结合物释放垫上的地美硝唑单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成地美硝唑-抗体-胶体金标记物。样本中的地美硝唑与反应膜检测线上的地美硝唑半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合地美硝唑单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带深浅来判断待测样品液中是否含有地美硝唑残留。

29、检测时，样品经处理后滴入样品吸收垫，当地美硝唑在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的地美硝唑半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(t)和质控线(c)上各出现一条红色条带，且t线显色比c线显色深或与c线显色一致；如果地美硝唑在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与地美硝唑全部结合，从而在t线处因为竞争反应不会与地美硝唑半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带或比c线显色浅。如图2所示。

30、阴性：当质控线(c)显示出红色条带，检测线(t)同时也显示出红色条带，且(t)线颜色接近或深于(c)线时，判为阴性。

31、阳性：当质控线(c)显示出红色条带，而检测线(t)不显色或(t)线颜色浅于(c)线时，判为阳性。

32、无效：当质控线(c)不显示出红色条带，则无论检测线(t)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。

33、本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、不受检测设备限制、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本发明试纸条检测地美硝唑残留的方法，简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。