一种精准寻址的荧光相关光谱智能采集方法及其装置

本发明涉及荧光显微成像与检测领域，尤其涉及一种精准寻址的荧光相关光谱智能采集方法及其装置。

背景技术：

1、荧光相关光谱(fluorescence correlation spectroscopy,fcs)最早在1972年由magde等人提出，是一种以光学显微镜为基础，通过测量极小检测区域内荧光分子因布朗运动而产生的荧光信号涨落，并对涨落信号进行相关函数分析后，从而获得荧光相关光谱曲线的单分子检测技术，通过研究荧光强度随时间或空间的变化，可以测量活细胞生物中的分子动力学、相互作用和结构变化，但由于计算机技术、光学技术以及光学检测技术的局限性，检测的灵敏性不高，并没有引起广泛的兴趣，1993年，首次提出将激光共聚焦扫描技术与fcs结合(confocal fcs)，使用激光共聚焦技术减小了样品的照射体积和检测体积(降低至10-15l，即1fl以下)，排除了散射光对测试的干扰，使得fcs的信噪比极大地提高，2005年在传统的单点fcs基础上，提出了光栅图像相关光谱(光栅图像相关光谱)技术，光栅图像相关光谱技术基于光栅扫描成像时荧光分子因布朗运动而产生的荧光信号涨落，在传统的单点fcs不仅能分析扩散动力学等，同时还能提高二维超分辨图像。

2、由于传统的confocal fcs只允许一次在一个小的检测体积内采集数据，不可能在一次采集过程就准确描述脂质或其他生物过程相互作用的时空特征，且如果激光功率过高，光毒性、光漂白等也是不容忽视的问题，同时这种传统的采集方式需要认为进行选择坐标进行单点的数据采集，这种随机性选址会严重影响结果的准确性，从而不利于对活细胞生物动力学的判断。

3、传统的光栅图像相关光谱在光栅扫描成像时，很大一部分区域是没有出现荧光或发生相互作用，但是却要花费很多的时间对这些区域进行扫描，这使得光栅图像相关光谱技术的时间分辨率变差，如何准确寻找感兴趣区域，提高时间分辨率，是现在光栅图像相关光谱技术必须解决的难题。

4、因此，有必要提供一种精准寻址的荧光相关光谱智能采集方法及其装置解决上述技术问题。

技术实现思路

1、本发明提供一种精准寻址的荧光相关光谱智能采集方法及其装置，解决了上述的问题。

2、为解决上述技术问题，本发明提供的；

3、一种精准寻址的荧光相关光谱智能采集装置的使用方法，具体步骤为：

4、步骤一、显微镜扫描模块进行一次寻址光栅式扫描成像；

5、步骤二、利用智能采集模块精准寻址出现荧光信号的目标区域，记录目标区域坐标，并将这些区域的坐标输入给显微镜扫描模块，实现对目标区域数据的精准采集；

6、步骤三、智能采集模块同步控制显微镜探测模块将采集到的荧光信号传输给电脑，根据时间或空间自相关函数，对数据进行分析，得到荧光相关光谱(fcs)曲线或光栅图像相关光谱曲线。

7、进一步地，智能采集模块是由现场可编程门阵列fpga开发板进行实时操控，智能采集模块先对精准寻址得到的坐标进行数据采集，两种采集方式，依次对坐标单点扫描的fcs分析或对一个区域光栅扫描的光栅图像相关光谱分析，并控制扫描振镜x轴、y轴实现对所有目标区域的数据采集。

8、进一步地，显微镜扫描系统完成寻址光栅扫描之后，单点扫描和光栅扫描采用如下的扫描方式：

9、第一种、记录的坐标在空间上依次排列，fpga开发板将第一个像素的坐标先传递给显微镜扫描系统，控制扫描振镜x轴、y轴的偏转角度，固定扫描时间，由单光子计数器探测数据，扫描完成后，fpga开发板将第二个坐标传递给显微镜扫描系统，重复上述过程，直到整个二维像素面上所有精准定位的坐标都采集完成，将采集到的数据传输到计算机上进行时间自相关分析；

10、第二种、记录的坐标在空间上依次排列，fpga开发板找到包含寻址坐标最多的256*256个像素，按传统的光栅扫描模式进行，从头开始扫描第一行，直到扫完第一行第256个像素，再调转到第二行扫描，重复上述过程，直到扫完256行，再从第一个像素开始重复光栅扫描，至少扫描10幅完整的256*256像素的图像，由光电探测器探测荧光信号，信号发送到计算机上进行空间自相关分析；

11、进一步地，在检测微区内荧光信号的强度在任一时间t的变化引起的涨落值δf(t)，可以由公式表示为：

12、δf(t)＝f(t)-<f(t)>

13、其中，f(t)代表t时刻下体系的荧光总强度，< >符号表示求解函数一定时间内的平均值；将检测微区内的荧光涨落值δf(t)与延迟时间相关，归一化的时间自相关函数g(τ)可以表示为：

14、

15、其中，延迟时间τ代表荧光分子在检测体积内停留的时间，f(t+τ)代表在任一时刻t在延迟时间τ之后的荧光强度，g(τ)代表延迟时间τ之后检测体积内分子运动状态的改变程度，使用时间自相关函数对单光子计数器采集到的数据进行分区处理，得到fcs曲线，探究活细胞生物中分子动力学等信息。

16、进一步地，利用光栅图像相关光谱分析从光栅扫描图像中提取分子动力学信息，光栅图像相关光谱分析有以下两个步骤：

17、第一步、背景减除需要去除静止或缓慢移动的物体，采用平均背景减法，从获得的需要进行分析的图像中减去一组连续图像的平均值；

18、第二步、光栅扫描下任意两个像素之间都有隐藏的时间结构，如果两个像素之间的荧光强度存在一定的相关性，用空间自相关函数一定可以将这个相关性展示出来，这种空间自相关函数可以表示为：

19、

20、其中，i(x,y)代表每个像素点上的荧光强度，ξ和ψ分别代表光栅扫描图像上x方向和y方向空间上的变化量，<>符号表示平均值，使用空间自相关函数对采集到的光栅图像进行分析，得到光栅图像相关光谱曲线，探究活细胞生物中分子动力学等信息。

21、进一步地，光电探测器上的荧光探针可以是量子点、有机染料或稀土上转换纳米颗粒任意一种荧光染料，稀土上转换纳米颗粒可以通过与nobf4反应，去除颗粒表面的油酸配体，使稀土上转换纳米颗粒溶于水中应用。

22、一种精准寻址的荧光相关光谱智能采集装置，包括激发光生成模块、显微扫描模块、fpga开发板和光电探测模块；

23、所述激发光生成模块包括红外连续激光器、滤光片、准直扩束镜、二分之一波片和偏振片；

24、所述显微扫描模块包括扫描振镜、扫描透镜、管镜、高反低透二向色镜和物镜；

25、光电探测模块包括聚焦透镜、光电探测器和单光子计数器。

26、与相关技术相比较，本发明提供的精准寻址的荧光相关光谱智能采集方法及其装置具有如下有益效果：

27、1、与传统confocal fcs技术相比，本发明利用一次寻址光栅式扫描成像，精准寻址到出现荧光的目标区域，并通过智能采集模块依次采集目标区域的数据，这有助于解决人为选择区域进行单点fcs数据采集时的随机性，精准寻址减少了选址出错而错误估计分子扩散动力学等信息的可能，同时fpga控制扫描振镜实现了对所有精准寻址坐标的自动化采集。

28、2、与传统光栅图像相关光谱技术相比，本发明利用一次光栅式扫描成像，精准寻址到出现荧光的目标区域，并通过智能采集模块在定位的区域中进行光栅式扫描，缩短了成像时间，同时较小的目标区域也缩短了后处理数据的时间。这有助于缩短传统光栅图像相关光谱技术扫描过程中对不感兴趣区域的成像时间，从而提高时间分辨率。

29、3、与传统的荧光相关光谱技术相比，本发明装置通过fpga控制，解决了传统confocal fcs与传统光栅图像相关光谱技术的一些不足之处，同时本装置可以直接切换两种采集方式，不需要进行光路、仪器设备的调整和切换，本发明装置仅通过fpga实现了智能采集，成本更低，可行性更高。