一种检测基质金属蛋白酶的电化学发光多肽传感方法

本发明属于电化学分析，涉及一种检测基质金属蛋白酶的电化学发光多肽传感方法。

背景技术：

1、基质金属蛋白酶(mmps)能降解细胞外基质中的各种蛋白成分，参与细胞外基质的降解和转运。基质金属蛋白酶在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，癌症的发生通常与多个mmps的高表达密切相关。例如，mmp-2和肿瘤的发生发展以及转移有很大的相关性。当人体受到炎症、损伤等刺激时，mmp-2在体内的含量就会有显著增加；此外，在海人酸大鼠癫痫模型中大脑中mmp-2被激活，mmp-2被认为是人类癫痫病的潜在生物标志物。人们还发现肺气肿、慢性阻塞性肺疾病和肺损伤等疾病与多种基质金属蛋白酶(mmp-2、3、9)相关，基质金属蛋白酶可直接降解肺内胶原和其它间质组织，导致肺组织破坏。因此，对于基质金属蛋白酶的测定对多种疾病的筛查和诊断有指导意义。目前，传统的基质金属蛋白酶检测方法，大多采用明胶聚丙烯酰凝胶电泳和酶联免疫吸附法，但是这些检测方法存在预处理繁琐，检测灵敏度低的技术问题。

2、电化学发光生物传感法是将生物识别反应转换为电化学发光信号从而定量分析目标物的分析方法。该法具有灵敏度高、背景低、仪器设备简单等优点，已在临床、环境以及食品等领域得到广泛应用。目前商品化的电化学发光免疫分析仪及其试剂盒虽然在临床检测上正在逐步替代放射免疫分析法，但是由于电化学发光分析法主要是利用抗原/抗体免疫反应的亲合型生物分析法，不能实现切割型酶类物质的检测。利用肽为分子识别物质的切割型蛋白酶分析方法，在蛋白酶类物质的检测中得到了人们的关注。

3、具有分子识别和信号转换作用的电化学发光信号探针的合成及性能研究是电化学发光生物传感的关键。目前公开的电化学发光生物传感检测蛋白酶的研究中，所使用的电化学发光探针在制备时通常基于共价耦合或将电化学发光信号物质嵌入双链dna等分子识别物质中获得。目前应用于蛋白酶检测的电化学发光探针的合成，具有一定的局限性。例如，共价标记通常需要将电化学发光信号物质共价标记在小分子肽链末端的巯基或氨基上获得，导致对目标物质识别时识别能力降低，信号物质的电化学发光效率也降低，降低了蛋白酶检测的灵敏度；且共价标记肽链时，一般需要额外的偶联试剂，操作步骤繁琐，标记速度慢。嵌入式标记一般是将信号物质嵌入双链dna中，需要设计与肽链偶联的dna。因此，开发出一种新型的具有高发光效率和高识别能力的电化学发光探针合成策略，建立快速灵敏高选择性的检测蛋白酶的分析方法，对疾病筛查、早期诊断和预后评价等具有重要意义。

技术实现思路

1、为了解决上述现有技术中存在电化学发光效率低、检测灵敏度低以及操作繁琐的技术问题，本发明提供一种检测基质金属蛋白酶的电化学发光多肽传感方法。

2、为了实现上述目的，本发明提出一种溶剂化环铱金属配合物(下称铱金属配合物)，与含有组氨酸的肽链通过配位作用标记肽链后得到电化学发光探针，利用“一锅”孵育实现基质金属蛋白酶检测，具有探针合成操作便捷、标记快速、反应条件温和及检测方法灵敏度高和易于操作的优点。本发明采用的方案具体如下：

3、一种检测基质金属蛋白酶的电化学发光多肽传感方法，包括以下步骤：

4、取肽链溶液、铱金属配合物溶液、磁性微粒mb@sa悬浮液混合，加入基质金属蛋白酶标准溶液，再用pb缓冲溶液定容后，恒温孵育混合物，得到磁珠复合物；

5、2)测定电化学发光强度

6、利用磁场作用将磁珠复合物富集到磁性玻碳电极表面，将其置于电解液中，采用循环伏安法测定磁珠复合物对应的电化学发光强度；

7、3)获得标准回归方程

8、3.1)参照步骤1)改变加入基质金属蛋白酶标准溶液的体积，得到含有不同浓度基质金属蛋白酶的磁珠复合物；参照步骤2)得到不同浓度基质金属蛋白酶反应后的磁珠复合物对应的电化学发光强度；

9、3.2)以基质金属蛋白酶浓度作为横坐标，磁珠复合物对应的电化学发光强度为纵坐标，线性回归得到标准回归方程：

10、(i0-i)＝acmmp+b；

11、其中：

12、i0为基质金属蛋白酶含量为0时混合物反应后得到磁珠复合物对应的电化学发光强度；

13、i为不同基质金属蛋白酶含量时混合物反应后得到磁珠复合物对应的电化学发光强度；

14、cmmp为基质金属蛋白酶的浓度，ng/ml；

15、a、b均为常数；

16、4)测定待测样品的基质金属蛋白酶浓度

17、取待测样品，按照步骤1)～步骤2)的方法，得到待测样品混合物反应后得到的磁珠复合物对应的电化学发光强度，代入步骤3)的标准回归方程中，反推得到待测样品中基质金属蛋白酶浓度。

18、进一步限定，所述步骤1)中，所述肽链溶液、铱金属配合物溶液和磁性微粒mb@sa悬浮液的体积比为3.2：2.5：5；用pb缓冲溶液定容后的总体积与铱金属配合物溶液的体积比为100：3。

19、进一步限定，所述步骤1)中，所述pb缓冲溶液浓度为10mmol/l；所述肽链溶液是含1mg/ml标准肽链的pb缓冲溶液；所述磁性微粒mb@sa悬浮液是含2.5mg/ml的链霉亲合素功能化磁珠的悬浮液；所述铱金属配合物溶液是含1mmol/l铱金属配合物的二甲亚砜溶液；所述蛋白酶标准溶液是含有100ng/ml基质金属蛋白酶的pb缓冲溶液。

20、进一步限定，所述标准肽链中包含有被基质金属蛋白酶特异性切割的氨基酸序列。

21、进一步限定，所述铱金属配合物的结构式为：

22、

23、进一步限定，所述基质金属蛋白酶为mmp-2，mmp-3，mmp-7或mmp-9。

24、进一步限定，所述步骤1)中，恒温孵育反应的条件是：温度37～37.5℃，时间0.5～2h。

25、进一步限定，所述步骤2.1)的pb缓冲溶液，浓度为10mmol/l，体积为15μl。

26、进一步限定，所述步骤2.2)的电解液是含50mmol/l tpa的pbs缓冲溶液；所述pbs缓冲溶液的浓度为0.1mol/l。

27、进一步限定，所述步骤2.2)中，循环伏安法的条件为：电位为0-1.6v,扫描速率为0.1v/s。

28、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

29、1、本发明建立的基于配位标记、生物切割与磁性富集的电化学发光多肽传感方法，集信号识别与转换为一体，采用“一锅”孵育进行基质金属蛋白酶的检测。在检测时，向离心管里依次加入铱金属配合物、生物素标记的末端带有组氨酸的且包含被基质金属蛋白酶特异性切割片段的标准肽链、链霉亲合素功能化磁珠和基质金属蛋白酶溶液后，于37℃恒温孵育2小时；利用磁场作用将磁珠复合物富集到磁性玻碳电极表面，在含tpa的溶液中检测电化学发光强度。根据标准曲线法测定基质金属蛋白酶浓度。检测方法简单易行，操作便捷；进一步利用磁性富集信号放大策略，显著提高了检测的灵敏度。

30、2、本发明中，电化学发光信号物质(铱金属配合物)与含有组氨酸的肽链通过简单混合，肽链中的组氨酸通过竞争作用与铱金属配合物中的铱发生配位反应，就能够得到电化学发光探针。此标记方法无需加入额外的偶联试剂，反应条件温和，实现了电化学发光探针的快速现场标记，避免了现有技术中电化学发光信号物质共价标记肽链步骤繁琐的问题；且铱金属配合物与肽链配位后，其电化学发光信号增强，避免了标记后电化学发光信号物质信号降低的问题。

31、3、本发明提供的基质金属蛋白酶检测方法，具有线性关系好、检出限低、选择性好的优势，尤其是对基质金属蛋白酶2的检测，在线性范围1～10ng/ml有非常高的灵敏度，检出限最低达到0.9ng/ml。

32、4、本发明的电化学发光多肽传感方法，以3-(2-吡啶基)-苯甲酸为主配体的铱金属配合物作为电化学发光信号物质，该铱金属配合物的化学式为c26h22clirn2o5s，是在主配体苯基吡啶的3号位上引入羧基，因此该铱金属配合物有很好的水溶性，且可长时间保存，稳定性好。