基于TiO2NTs的外泌体分离与SERS检测一体化方法

本发明涉及生物医药，具体为基于tio2nts的外泌体分离与sers检测一体化方法。

背景技术：

1、外泌体(exosome)是由包括癌症细胞在内的活细胞释放到周围生物流体中的小囊泡，这些外泌体含有肿瘤来源的物质，如rna、dna、脂质、蛋白质、糖类结构等，起到细胞间信号传递的作用，从而调控生理病理过程，研究表明，通过分析细胞培养液、血液、尿液、唾液中外泌体携带的物质，能够反应来源细胞的情况、预测疾病的发生和发展、并已成为癌症诊断的一种理想的标记物。

2、但是目前有关外泌体的分离和检测方法仍存在挑战。超速离心法是目前进行外泌体分离的金标准，但所需设备成本高、运行时间长、步骤复杂；免疫亲合法是近年来提出的对外泌体进行分离的新方法，能够根据其特定的标记来分离外泌体，具有一定的特异性，但试剂成本高、步骤繁琐、耗时且产量低，关于外泌体的检测，当前常用的方法有透射电镜、蛋白质免疫印迹技术(western blot，wb)、酶联免疫吸附测定(enzyme linkedimmunosorbent assay，elisa)技术等，但仍存在需要昂贵的检测仪器，成本高、操作步骤复杂、耗时等不足，基于此提出基于tio2nts的外泌体分离与sers检测一体化方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了基于tio2nts的外泌体分离与sers检测一体化方法，具备利用tio2nts与外泌体之间的特异性结合性能，以及纳米金对拉曼信号的放大能力，实现对样品中的外泌体进行快速、高灵敏度的定量分析等优点，解决了现有技术中样品处理复杂、分离及检测过程费时、成本高的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于tio2nts的外泌体分离与sers检测一体化方法，包括以下步骤：

3、s1、将样本置于离心管中，4℃温度2000g的转速下离心10min，待除去大分子物质及碎片后，将离心后的上清液使用0.2μm过滤器进行过滤，收集到新的离心管中备用；

4、s2、合成tio2纳米管结构，与步骤s1中得到的含外泌体的样本共孵育，实现溶液中外泌体的分离及在tio2nts表面的捕获(tio2nts@exo)；

5、s3、将纳米金自组装在tio2nts@exo表面，并获得外泌体的增强拉曼信号，通过测得拉曼信号实现对外泌体的定性及定量检测。

6、优选的，步骤s1中所述的样本为细胞培养液、血清、血浆中的一种。

7、优选的，所述步骤s2中，tio2纳米管制备方法如下：

8、(1)将0.5cmx0.5cm的钛片先后用去离子水、无水乙醇、丙酮各超声清洗10min，吹干，然后采用阳极氧化法，钛片接正极，用铂电极做负极，放入制备好的电解液中，在30v电压下反应1h，电解后将钛片冲洗干净并吹干；

9、(2)将经过上步处理好的钛片放入450℃马弗炉中退火2h，退火完成后分别用无水乙醇、去离子水各超声清洗10s，得到tio2nts结构。

10、优选的，步骤s2中所述样本量为0.2～1ml，所述血浆或血清的样本需要进行同等体积稀释。

11、优选的，所述步骤s3中，纳米金在tio2nts@外泌体表面自组装的方法如下：

12、(1)纳米金溶胶的制备，取100ml浓度为0.01％的氯金酸溶液，放置于磁力搅拌器上，边搅拌边加热，待沸腾时快速添加1ml浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，持续搅拌15min，停止加热，冷却放置于4℃冰箱备用。

13、(2)将tio2nts@外泌体放置于2％的pdda中30min，去离子水冲洗，再放置于纳米金溶胶中，4℃摇床孵育30min，取出后去离子水冲洗。

14、与现有技术相比，本申请的技术方案具备以下有益效果：

15、该基于tio2nts的外泌体分离与sers检测一体化方法，具有操作简单的特点，无需超速离心即可完成抽提和纯化，大大缩短了提取时间，也满足了高效提取的需求，并进一步将sers原位检测技术运用到外泌体检测中进行精确的定性以及定量分析，可实现快速高灵敏的外泌体检测。

技术特征：

1.基于tio2nts的外泌体分离与sers检测一体化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于tio2nts的外泌体分离与sers检测一体化方法，其特征在于：步骤s1中所述的样本为细胞培养液、血清、血浆中的一种。

3.根据权利要求1所述的基于tio2nts的外泌体分离与sers检测一体化方法，其特征在于：所述步骤s2中，tio2纳米管制备方法如下：

4.根据权利要求1所述的基于tio2nts的外泌体分离与sers检测一体化方法，其特征在于：步骤s2中所述样本量为0.2～1ml，所述血浆或血清的样本需要进行同等体积稀释。

5.根据权利要求1所述的基于tio2nts的外泌体分离与sers检测一体化方法，其特征在于：所述步骤s3中，纳米金在tio2nts@外泌体表面自组装的方法如下：

技术总结
本发明属于生物医药领域，涉及基于T iO<subgt;2</subgt;NTs的外泌体分离与SERS检测一体化方法，先对样本进行低速离心以去除死细胞等杂质，然后利用T iO<subgt;2</subgt;的强吸附作用及三维纳米管结构的大比表面积，对外泌体脂质的磷酸基团进行特异性吸附，进而从样本溶液中实现快速地、大量地、精准地外泌体富集，然后在T iO<subgt;2</subgt;NTs@外泌体表面进一步自组装纳米金颗粒，利用共聚焦拉曼显微系统，获得增强的外泌体的SERS信号。本发明所提供的外泌体分离与SERS检测一体化方法具有操作简单的特点，无需超速离心即可完成抽提和纯化，大大缩短了提取时间，也满足了高效提取的需求，并进一步将SERS原位检测技术运用到外泌体检测中进行精确的定性以及定量分析，可实现快速高灵敏的外泌体检测。

技术研发人员：王春艳,江怡娜,李希望,刘燕林,张覃
受保护的技术使用者：重庆理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15