一种强抗干扰、高灵敏比色-荧光-上转换发光的三模试剂检测过氧化氢

本发明属于分析检测领域，提供了一种强抗干扰、高灵敏比色-荧光-上转换发光的三模试剂检测过氧化氢。

背景技术：

1、过氧化氢作为制备过氧化爆炸物的主要原料，同时又是过氧化爆炸物的分解产物，因此，对过氧化氢进行现场的超灵敏、快速、特异性精准识别检测具有重要现实意义。

2、目前，鉴于对过氧化氢检测的特殊意义，国内外学者开展了大量研究，荧光检测技术由于具有灵敏度高、反应速度快、特异性强、检测信号可视化和操作简便等特点受到广泛关注。目前为止，科研人员已经探索了大量的有机小分子荧光探针用于检测过氧化氢。如，中国专利cn 109060739报道了一种将硼氮芳环化合物负载到薄膜上的荧光传感材料，传感薄膜本身荧光较弱，遇到过氧化氢后发出较强的荧光，从而实现对过氧化氢的检测；中国专利cn 108623611报道一种能特异性识别过氧化氢的罗丹明类衍生物荧光探针，荧光探针其本身几乎无荧光，在与过氧化氢作用后迅速有很强的荧光发射；中国科学院大连化学物理研究所韩克利研究员课题组设计合成了多巴胺-花菁素荧光探针实现对过氧化氢的荧光猝灭检测(chemical communications 2012,48,4980-4982)。然而，荧光检测技术作为一种单通道检测技术，在实际应用场景，不可避免地会受到荧光背景和生活中常见的复杂物质(如灰尘、荧光染料或植物)的荧光干扰，导致检测结果不可靠。因此，基于有机小分子荧光探针的高抗干扰检测的定向设计对实现超精确可视化检测具有重要意义。

3、解决此问题一种常用且高效的策略是构建双模可视化检测平台，生成两个独立的检测信号，从而有效降低外部环境的影响和潜在干扰。目前，科研人员开发了许多比色和荧光一体化双模检测的有机小分子荧光探针。如，湖南师范大学李海涛教授课题组设计合成了(e)-2-(2-(4-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苄基)氧基)苯乙烯基)-4h-甲烯-4-亚基)丙二腈有机小分子荧光探针，实现了对过氧化氢检测后，溶液颜色从黄色到紫色，荧光从无色变为红色的比色和荧光双模检测(sensors and actuators b:chemical 2019,280,120-128)；华东理工大学吴君臣课题组设计了一种基于调节1,8-萘酰亚胺硼酸和花青素荧光染料之间荧光共振能量转移的探针，实现了检测过氧化氢后，颜色从无色到蓝色，荧光从蓝色到红色的比色和荧光双模检测(dyes and pigments 2018,155,143-149)。然而，大多数已报道的双模检测平台中的有机小分子荧光探针在被高能量光激发的同时发出低能量荧光，在复杂应用场景中容易受到有颜色和荧光物质的干扰，导致检测不准确、不可靠。相比之下，稀土掺杂上转换纳米材料可将低能量的近红外光转换为高能量的紫外光或可见光，由于其独特的上转换发光机理，使其具有光化学稳定性高、自发荧光信号低、信噪比优异和发光范围广等显著优势，可有效避免复杂环境的背景干扰，如，中国药科大学顾月清课题组设计合成了一种以上转换纳米材料为能量供体，二氰基甲基4h-吡喃为能量受体的上转换纳米探针，当过氧化氢存在时，上转换发光从绿色变为红色(acsappl mater interfaces 2019,11,7441-7449)，虽然此上转换纳米探针实现了对复杂环境中有颜色物质和有荧光物质的干扰，但是，此体系对过氧化氢检测限却相对较高为0.168μm。因此，如何利用具有高灵敏度的有机小分子荧光探针和具有强抗干扰能力的稀土掺杂的上转换纳米材料，探索一种简便而高效的策略实现对过氧化氢的高灵敏度和强抗干扰性的多模检测，是一个重大而有价值的挑战。

技术实现思路

1、本发明目的在于，提供了一种强抗干扰、高灵敏比色-荧光-上转换发光的三模试剂检测过氧化氢，该试剂由n-正己酸-4-硼酸频哪醇酯-1,8-萘酰亚胺有机小分子荧光探针、nayf4,yb,tm油酸包裹的稀土掺杂上转换纳米材料、四丁基氢氧化铵催化剂和乙醇和超纯水混合溶剂构成。本发明所述的三模试剂对过氧化氢具有比色、荧光和上转换发光检测的功能，该三模试剂本身为浅黄色溶液，与过氧化氢接触5s内变为金色，在468nm蓝光激发下，荧光由绿色变为黄绿色，在980nm近红外光激发下，上转换发光由蓝色变为红色。该三模试剂具有超强的抗干扰性和极好的检测限，检测过程无需复杂的分析设备，实现了对过氧化氢的快速痕量检测，同时，弥补了在复杂环境检测过氧化氢时背景干扰的影响。因此，该三模试剂的开发可为实际环境中对非制式爆炸物痕量检测领域提供有效的技术支撑。

2、本发明所述的一种强抗干扰、高灵敏比色-荧光-上转换发光的三模试剂检测过氧化氢，具体操作按下列步骤进行：

3、制备三模试剂：

4、a、该试剂是由1mm的n-正己酸-4-硼酸频哪醇酯-1,8-萘酰亚胺有机小分子荧光探针、0.5mg/ml的nayf4,yb,tm油酸包裹的稀土掺杂上转换纳米材料、1mm的四丁基氢氧化铵催化剂和体积比为18:1的乙醇和超纯水混合溶剂构成，将2mm的n-正己酸-4-硼酸频哪醇酯-1,8-萘酰亚胺有机小分子荧光探针加入到1ml乙醇中混合均匀，再将1.25mg/ml的nayf4,yb,tm油酸包裹的稀土掺杂上转换纳米材料加入到0.8ml乙醇中混合均匀，再将20mm的四丁基氢氧化铵催化剂加入到0.1ml超纯水中混合均匀，然后再将乙醇混合液与超纯水混合液混合均匀即得到三模试剂；

5、利用三模试剂检测过氧化氢：

6、b、将步骤a得到的三模试剂置于石英比色皿中，加入过氧化氢后，在5s内，溶液颜色迅速从浅黄色变为金色，在468nm蓝光激发下，荧光从绿色变为黄绿色，在980nm近红外光激发下，上转换发光从蓝色变为红色；当过氧化氢浓度为0μm-125μm时，454nm处的吸收峰强度与过氧化氢浓度呈线性关系，检测限为375.00nm；当过氧化氢浓度为0μm-70μm时，558nm处的荧光发射峰强度与过氧化氢浓度呈线性关系，检测限为4.34nm；当过氧化氢浓度为0μm-200μm时，478nm处的上转换发射峰强度与646nm处的上转换发射峰强度比值与过氧化氢浓度呈线性关系，检测限为94.36nm。

7、所述三模试剂检测过氧化氢具有强抗干扰性，该试剂在具有金色颜料存在的环境中，可通过荧光通道和上转换发光通道判别过氧化氢；在具有黄绿色荧光染料存在的环境中，可通过比色通道和上转换发光通道判别过氧化氢；在同时具有金色颜料和黄绿色荧光染料存在的环境中，可通过上转换发光通道判别过氧化氢。

8、本发明所述的一种强抗干扰、高灵敏比色-荧光-上转换发光的三模试剂检测过氧化氢，其检测原理为：有机小分子荧光探针n-正己酸-4-硼酸频哪醇酯-1,8-萘酰亚胺的识别位点为硼酸频哪醇酯，可与过氧化氢在四丁基氢氧化铵催化剂的作用下水解为苯酚，使得荧光团1,8-萘酰亚胺产生分子内电荷转移的过程，本发明有机小分子荧光探针上羧酸基团的独特设计，可以消耗其与过氧化氢反应过程中产生的羟基，有效促进了反应进程，从而极大的提高了有机小分子荧光探针对过氧化氢检测的响应速率和灵敏度。实现了溶液颜色迅速从浅黄色变为金色，在468nm蓝光激发下，荧光从绿色变为黄绿色。除此之外，稀土掺杂上转换纳米材料的发射光谱与过氧化氢诱导的产物分子的紫外-可见吸收光谱大范围重叠而产生内滤波效应，使得在980nm近红外光激发下，上转换发光从蓝色变为红色，最终实现对过氧化氢的比色-荧光-上转换发光三模检测。该三模试剂具有精准识别、特异性强、灵敏度高、反应速度快、操作简便及利于推广应用等特点。

9、本发明所述的一种强抗干扰、高灵敏比色-荧光-上转换发光的三模试剂检测过氧化氢，具体方法如下：

10、量取过氧化氢稀释在超纯水中，配制成0mm、0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8mm、1.0mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、4.0mm、5.0mm和6.0mm的过氧化氢水溶液；

11、用移液枪量取1.9ml同一配比的三模试剂于试剂瓶，分别加入100μl不同浓度的过氧化氢水溶液后，用数码相机记录反应前后的比色检测图像、荧光检测图像和上转换发光图像；

12、或用移液枪量取1.9ml三模试剂置于石英比色皿中，再加入不同浓度的过氧化氢水溶液100μl，用紫外-可见分光光度计进行紫外-可见吸收光谱扫描，测定三模试剂在检测不同浓度过氧化氢后的紫外-可见吸收光谱，再以最大吸光度为纵坐标，过氧化氢浓度为横坐标，拟合得到一元一次方程，从而确定三模试剂的比色检测限；

13、或用移液枪量取1.9ml三模试剂置于石英比色皿中，再加入不同浓度的过氧化氢水溶液100μl，用荧光光谱仪进行荧光发射光谱扫描，测定三模试剂在检测不同浓度过氧化氢后的荧光发射光谱；再以最大荧光发射峰强度为纵坐标，过氧化氢浓度为横坐标，拟合得到一元一次方程，从而确定模检测体系的荧光检测限；

14、或用移液枪量取1.9ml三模试剂置于石英比色皿中，再加入不同浓度的过氧化氢水溶液100μl，用荧光光谱仪进行上转换发射光谱扫描，测定三模试剂在检测不同浓度过氧化氢后的上转换发射光谱；再以最大上转换发射峰强度为纵坐标，过氧化氢浓度为横坐标，拟合得到一元一次方程，从而确定三模试剂的上转换发光检测限；

15、本发明所述的一种强抗干扰、高灵敏比色-荧光-上转换发光的三模试剂检测过氧化氢，主要针对爆炸物前驱体过氧化氢进行检测，解决了当前无法在复杂环境中针对过氧化氢精准、快速、可视化、高灵敏检测的难题。

16、本发明所述的一种强抗干扰、高灵敏比色-荧光-上转换发光的三模试剂检测过氧化氢的效果，其三模试剂本身为浅黄色溶液，与过氧化氢接触5s内立即变为金色，在468nm蓝光激发下，荧光从绿色变为黄绿色，在980nm近红外光激发下，上转换发光从蓝色变为红色。该三模试剂具有超强的抗干扰性，不受常见的氧化剂(过硫酸钠、溴酸钠、亚硝酸钠等)、易制爆原料(高氯酸钠、氯酸钾、尿素等)、水溶性金属盐(乙酸钠、氯化钠、溴化钾等)、生活日用品(洗洁精、洗手液、香水等)以及复杂环境(具有金色颜料、黄绿色荧光染料)的干扰。此外，此三模试剂具有极低的检测限(紫外-可见检测限为375.00nm，荧光检测限为4.34nm，上转换发光检测限为94.36nm)。该三模试剂弥补了在复杂环境中检测过氧化氢时背景干扰，为光学检测领域提供了有效的技术手段。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

18、1、本发明所述的三模试剂能够在复杂环境中实现对过氧化氢的强抗干扰检测；

19、2、本发明所述的三模试剂对过氧化氢具有半定量的能力，同时通过比色通道和荧光通道与上转换发光通道相结合的方式，达到自校准的功能，从而实现对过氧化氢的精准检测；

20、3、本发明所述的三模试剂中有机小分子荧光探针上羧酸基团的独特设计，使得对过氧化氢检测灵敏度高，检测限低至4.34nm，检测速度快，5s内就可以在比色、荧光和上转换发光通道实现检测；

21、4、本发明所述的三模试剂检测过氧化氢，无需复杂的分析设备，可以直接裸眼识别检测；

22、5、本发明所述的三模试剂无需将待测物进行任何的前期处理，操作简单，方便推广应用，完全可以实现低成本的比色、荧光和上转换发光的三模试剂检测过氧化氢目的。