一种肺癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群的检测方法

本发明涉及细胞检测。具体地说是一种肺癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群的检测方法。

背景技术：

1、流式细胞术(flow cytometry，fcm)是一种对单个细胞表面或细胞内化学成分的不同，对不同类型细胞进行荧光定量分析的新技术。其工作原理是对单个细胞或分子进行荧光标记后，通过识别细胞表面特异的免疫荧光信号，进行多参数的定量分析，其主要通过采集前向散射光(fsc)将体积大小不同的细胞分开，并采集侧向散射光(ssc)将胞内粒度不同的细胞分开，进而通过识别细胞表面和细胞内特异的荧光标记，实现对dna、rna、细胞因子、细胞表面抗原等的检测，有助于评价机体的细胞免疫功能。

2、肺癌肿瘤浸润淋巴细胞各亚群在肿瘤免疫微环境中扮演各自重要的角色，多色流式细胞术的发展使得能检测的标记数量越来越多，流式细胞术也因此广泛应用于科研工作与临床实践中。但由于多色流式细胞术普遍存在荧光补偿问题，流式常规临床检测中，需要同时标记几管细胞才能完成20种左右抗体的检测。为了便于分析不同管中某种细胞的表型，需要重复使用较多的设门抗体，使得检测的抗体总数较多，成本较高，如果控制成本，减少重复设门抗体数目，则难以精确分析不同管中细胞所检测抗体之间的关系，此外，由于需要几管抗体组合才能完成检测，而每管选择的抗体种类、克隆号及荧光素均不同，这些均会严重影响抗体检测的结果。

技术实现思路

1、为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种肺癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群的检测方法，能够在仅使用一管样本的条件下检测肿瘤免疫微环境中数十种免疫细胞亚型，验证肿瘤免疫微环境中的浸润淋巴细胞分析来源及功能状态，较全面的解析肿瘤免疫微环境，节省了样本用量，也避免了多管检测引起的设门抗体浪费和难以评估抗体建关系的难题。

2、为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

3、一种肺癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群的检测方法，包括如下步骤：

4、s1、制备单细胞悬液，将包含浸润边缘的肺癌肿瘤组织标本经单细胞组织解离后获得单细胞悬液；

5、s2、活死细胞染色，向单细胞悬液中加入活死细胞染料，混匀后避光染色，再经pbs清洗、离心、重悬后加入人-ab血清进行抗体封闭；

6、s3、抗体染色孵育，根据tils鉴定方案，取封闭后的单细胞悬液一份，加入pd-1单抗，混匀后避光染色，经pbs清洗、离心、重悬后，使用流式细胞仪上机检测；

7、s4、分析检测结果，使用flowjo软件分析数据，获得肺癌肿瘤浸润淋巴细胞各亚群淋巴细胞的比例。

8、更进一步地，s1中，单细胞悬液的制备过程如下：

9、a1、肺癌肿瘤组织标本采集完成后完全浸泡于4℃rpmi+10％fbs溶液内并存放于冰盒内备用；

10、a2、将存放不超过2小时的肺癌肿瘤组织标本用4℃1x pbs漂洗，然后用消毒手术刀片反复切碎至组织呈泥状；

11、a3、将切碎的肺癌肿瘤组织标本转移至装有组织消化溶液的2ml离心管内充分混匀，并在37℃下水浴1小时，待消化完全后用16-gauge针头和40μm细胞滤网过滤，获得滤液；

12、a4、将滤液经pbs清洗后放入4℃预冷离心机中，以500g离心转速离心5min，弃上清液，再加入100μl pbs液，重悬细胞沉淀，获得单细胞悬液。

13、更进一步地，所述组织消化溶液采用complete media+0.225mg/ml collagenasetype iv。

14、更进一步地，s2中，活死细胞染料的用量为0.5μl，活死细胞染料采用live/deadfixable blue dead cell stain；

15、单细胞悬液和活死细胞染料混匀后置于冰上避光染色30min，用1ml pbs清洗，并在4℃预冷离心机以500g离心转速离心5min；

16、抗体封闭时，将离心后的单细胞悬液和活死细胞染料混合液用50μl pbs重悬并加入1μl人-ab血清充分混匀，置于冰上避光封闭10min。

17、更进一步地，s3中，pd-1单抗加入后充分混匀并置于冰上避光染色30min，然后加入pbs液清洗，在4℃预冷离心机以500g离心转速离心5min，再用pbs重悬，在无菌条件下用40μm细胞筛过滤，将其置于流式上机管中。

18、更进一步地，s3中，使用流式细胞仪上机检测时，包括：

19、a、确定电压和补偿：按照光谱流式细胞仪的既定操作设定电压，根据染色方案的荧光配色制备单染样本，用于仪器设定；

20、b、仪器设置、校正和质控：开机预热机器20min并冲洗，检测内质控品，使各检测值在控制范围内，调取al-panal上样，采集数据；

21、c、上机检测：按照预设的仪器条件，单个流式上机管获取5-10万细胞。

22、更进一步地，使用流式细胞仪上机检测时，利用fsc/ssc去除碎片、黏连细胞及死细胞，将活的单个细胞设门r1圈出淋巴细胞，从淋巴细胞中圈出cd45+/l-d-范围内的细胞，确定为肿瘤浸润淋巴细胞；

23、从肿瘤浸润淋巴细胞中圈出l-d-cd45+cd19+的细胞，确定为b淋巴细胞群；

24、从肿瘤浸润淋巴细胞中圈出cd19-cd56+cd3-的细胞，确定为nk细胞群，从肿瘤浸润淋巴细胞中圈出cd19-cd56+cd3+的细胞，确定为nkt细胞群；

25、从肿瘤浸润淋巴细胞中圈出cd19-cd3-cd11c+hla-dr+的细胞，确定为dc细胞群；

26、从肿瘤浸润淋巴细胞中圈出cd19-cd3+cd8+cd4-的细胞，确定为细胞毒性t淋巴细胞；

27、从肿瘤浸润淋巴细胞中圈出cd19-cd3+cd8-cd4+的细胞，确定为辅助性t淋巴细胞。

28、更进一步地，从b淋巴细胞群中圈出cd27+cd38+的细胞，确定为浆细胞群，从浆细胞群中圈出cd39+的细胞，确定为具有耗竭特性的浆细胞亚群；

29、从细胞毒性t淋巴细胞中圈出cd27/cd62l/ccr7/cd45ra抗体的细胞，确定其记忆特征，从细胞毒性t淋巴细胞中圈出pd-1/cd39抗体的细胞，确定其耗竭特性，从细胞毒性t淋巴细胞中圈出cd103抗体的细胞，确定其组织驻留表型，从细胞毒性t淋巴细胞中圈出hla-dr抗体的细胞，确定其活化表型；

30、从辅助性t淋巴细胞中圈出cd27/cd62l/ccr7/cd45ra抗体的细胞，确定其记忆特征，从辅助性t淋巴细胞中圈出pd-1/cd39抗体的细胞，确定其耗竭特性，从辅助性t淋巴细胞中圈出cd103抗体的细胞，确定其组织驻留表型，从辅助性t淋巴细胞中圈出cxcr5抗体的细胞，确定其趋化因子受体。

31、本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：

32、1、本发明一种肺癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群的检测方法，基于传统流式细胞仪的条件下，建立了多色流式检测方案用于肿瘤浸润淋巴细胞亚群的检测和分析，具有较好的客观性和重复性。

33、2、本发明一种肺癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群的检测方法，在仅使用一管样本的条件下检测肿瘤免疫微环境中数十种免疫细胞亚型，验证肿瘤免疫微环境中的浸润淋巴细胞分析来源及功能状态，全面的解析肿瘤免疫微环境，节省了样本用量，也避免了多管检测引起的设门抗体浪费和难以评估抗体建关系的难题；相对于单细胞测序分析而言，多色流式分析技术使用成本更低，临床适用性更强，且能提供与单细胞测序数据相当的细胞分型信息，可同时检测的标记数目远大于多色荧光技术。