本发明涉及临床医学参数检测，具体涉及一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
1、天门冬氨酸氨基转移酶(ast)广泛存在于心、肝、肺等组织细胞内，其有两种同工酶，一种是存在于细胞胞浆中，称为胞浆天门冬氨酸氨基转移酶(c-ast)，另一种是存在于线粒体中的天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶(m-ast)。ast浓度变化具有重要的临床诊断意义，其中m-ast能够比较客观地反映一些疾病的严重程度，能够作为一些疾病指导治疗及预后判断指标的重要参考。
2、目前，对于m-ast的检测方法主要有电泳法、离子交换法、酶免疫法、放射性免疫法等。电泳法需要复杂的染色过程，不适用于大量样本的临床检测；离子交换法需要使用层析柱，不能达到快速检测的目的；酶免疫法自动化程度低，耗费较多人力；放射性免疫法具有放射性，对环境不友好。
3、m-ast的酶动力学法是根据m-ast催化的化学反应的速度反推m-ast的酶活或者浓度，具有操作可自动化、样本通量大，检测时间短等优势。检测基本原理是：mast催化l-天冬氨酸和α-酮戊二酸生成草酰乙酸和l-谷氨酸，草酰乙酸被苹果酸脱氢酶(mdh)还原成l-苹果酸，同时还原型辅酶ⅰ(nadh)被氧化为氧化型辅酶ⅰ(nad+)，从而使340nm处的吸光度下降。通过监测340nm处吸光度下降的速率，可以计算出样品中mast的活性。但是容易受到c-ast的干扰，导致检测结果偏差较大的问题。因此需要开发一种能够消除c-ast干扰，准确测定m-ast浓度的检测试剂盒及其制备方法。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒及其制备方法，通过在试剂盒中增设胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性吸附膜将待测样本中的c-ast去除，消除测定干扰，并同时去除待测样本中原始存在的l-天冬氨酸和α-酮戊二酸，降低背景值，提高检测精度。
2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒，所述检测试剂盒包括胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性吸附膜、第一试剂、第二试剂和第三试剂；
4、所述胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性吸附膜的结构为：两层醋酸纤维素膜中间区域夹有丙烯酸系凝胶型阴离子交换树脂颗粒；
5、所述两层醋酸纤维素膜中间区域是指除距膜边缘2-5mm区域以外的膜中间区域；
6、所述醋酸纤维素膜为负载胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性单克隆抗体的醋酸纤维素膜；
7、所述胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性单克隆抗体由第一特异性单克隆抗体和第二单克隆抗体按照摩尔比1:2-2:1组成，所述第一特异性单克隆抗体对应的抗原决定簇氨基酸序列为lan hle iyg lle fas nam rla，所述第二特异性单克隆抗体对应的抗原决定簇氨基酸序列为kei asn mkh rql fpf fgs；
8、所述第一试剂包括第一缓冲液30-110mmol/l、氢氧化钾0.5-0.6mmol/l、丙三醇0.3-1.2g/l、聚乙二醇0.1-0.9g/l、乙醇胺0.1-2mmol/l、还原型辅酶ⅰnadh200-270 mmol/l、第一抑菌剂30mg/l-69mg/l、抗氧化剂140-310mg/l；
9、所述第二试剂包括第二缓冲液60-90mmol/l、苹果酸脱氢酶3-6ku/l、表面活性剂20-67mmol/l、第二抑菌剂50mg/l-90mg/l、蛋白稳定剂40-70mmol/l；
10、所述第三试剂包括第三缓冲液50-100mmol/l、l-天冬氨酸30-50mmol/l、α-酮戊二酸30-50mmol/l、第三抑菌剂40mg/l-80mg/l。
11、优选地，所述醋酸纤维素膜的孔径为0.45微米。
12、优选地，所述丙烯酸系凝胶型阴离子交换树脂包括弱碱性阴离子交换树脂。
13、优选地，所述丙烯酸系凝胶型阴离子交换树脂颗粒的层数为1-3层，所述丙烯酸系凝胶型阴离子交换树脂颗粒的粒径为0.9-1.3微米。
14、优选地，所述第一抑菌剂和第三抑菌剂包括庆大霉素，第二抑菌剂包括叠氮钠，第一缓冲液和第三缓冲液包括磷酸盐缓冲液，第二缓冲液为tris缓冲液，表面活性剂包括月桂酰二乙醇胺、吐温60、吐温80中的至少一种，抗氧化剂包括维生素c，蛋白稳定剂包括烷基糖苷、低聚海藻糖中的至少一种。
15、优选地，所述天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒还包括膜洗涤试剂，所述膜洗涤试剂包括第一缓冲液30-110mmol/l、氢氧化钾0.06-0.09mmol/l、丙三醇0.3-1.2g/l、聚乙二醇0.1-0.9g/l、第一抑菌剂30mg/l-69mg/l、抗氧化剂140-310mg/l。
16、第二方面，本发明还提供一种如上所述天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
17、制备胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性单克隆抗体：按照常规方法制备所述第一特异性单克隆抗体和第二特异性单克隆抗体，所述第一特异性单克隆抗体和第二特异性单克隆抗体为羊抗人单克隆抗体；所述用于制备第一特异性单克隆抗体的抗原决定簇氨基酸序列为lan hle iyg lle fas nam rla，所述用于制备第二特异性单克隆抗体的抗原决定簇氨基酸序列为kei asn mkh rql fpf fgs；
18、制备负载胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性单克隆抗体的醋酸纤维素膜：将所述醋酸纤维素膜浸没于磷酸缓冲液中，加入活化剂nhs-edc，搅拌均匀，加入一定量的吗啉和邻羟基苯乙酸，按照摩尔比1:2-2:1加入所述第一特异性单克隆抗体和第二特异性单克隆抗体，搅拌均匀后孵育一定时间，得到所述负载胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性单克隆抗体的醋酸纤维素膜；
19、制备丙烯酸系凝胶型阴离子交换树脂颗粒：将去除表面水的丙烯酸系凝胶型阴离子交换树脂颗粒使用粉碎机粉碎，得到丙烯酸系凝胶型阴离子交换树脂小颗粒，再采用水力筛分法对所述丙烯酸系凝胶型阴离子交换树脂小颗粒进行筛分，得到粒径为0.9-1.3微米的树脂小颗粒；
20、制备胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性吸附膜：将贻贝黏蛋白的醋酸溶液均匀喷涂于所述负载胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性单克隆抗体的醋酸纤维素膜的一面的中心位置，边缘预留2-5mm的区域不喷涂，喷涂量为10-30ml/m2，在28-36℃下干燥30-70min，所述醋酸溶液质量浓度为0.1％-0.3％，所述贻贝黏蛋白在所述醋酸溶液中的质量浓度为0.5％-1.3％，得到一面覆盖贻贝黏蛋白的负载胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性单克隆抗体的醋酸纤维素膜；将所述粒径为0.9-1.3微米的树脂小颗粒均匀涂覆在所述一面覆盖贻贝黏蛋白的负载胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性单克隆抗体的醋酸纤维素膜，在未覆盖贻贝黏蛋白的一面通入无菌空气，将未粘附的树脂颗粒吹脱，同时在贻贝黏蛋白层形成气液通道；在所述一面覆盖贻贝黏蛋白的负载胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性单克隆抗体的醋酸纤维素膜边缘预留的未喷涂区域喷涂胶水，将两片所述一面覆盖贻贝黏蛋白的负载胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性单克隆抗体的醋酸纤维素膜的边缘预留区域压合，涂覆树脂颗粒的面相对，形成两片所述负载胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性单克隆抗体的醋酸纤维素膜包裹所述树脂颗粒的结构，得到所述胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性吸附膜；
21、配制第一试剂：根据需要配制第一试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料，第一缓冲液30-110mmol/l、氢氧化钾0.5-0.6mmol/l、丙三醇0.3-1.2g/l、聚乙二醇0.1-0.9g/l、乙醇胺0.1-2mmol/l、还原型辅酶ⅰnadh200-270 mmol/l、第一抑菌剂30mg/l-69mg/l、抗氧化剂140-310mg/l，得到所述第一试剂；
22、配制第二试剂：根据需要配制第二试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料，第二缓冲液60-90mmol/l、苹果酸脱氢酶3-6ku/l、表面活性剂20-67mmol/l、第二抑菌剂50mg/l-90mg/l、蛋白稳定剂40-70mmol/l，得到所述第二试剂；
23、配制第三试剂：根据需要配制第三试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料，第三缓冲液50-100mmol/l、l-天冬氨酸30-50mmol/l、α-酮戊二酸30-50mmol/l、第三抑菌剂40mg/l-80mg/l，得到所述第三试剂。
24、优选地，还包括将所述丙烯酸系凝胶型阴离子交换树脂颗粒浸泡在碱性溶液溶液中转型的步骤，所述碱性溶液包括氢氧化钠、氢氧化钾、氨水，所述碱性溶液的浓度为1.3-2.0mol/l。
25、优选地，所述贻贝黏蛋白是指从贻贝的足丝组织中分离得到的具有粘合作用的蛋白质。
26、优选地，还包括膜洗涤试剂的配制步骤，根据需要配制膜洗涤试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料，第一缓冲液30-110mmol/l、氢氧化钾0.06-0.09mmol/l、丙三醇0.3-1.2g/l、聚乙二醇0.1-0.9g/l、第一抑菌剂30mg/l-69mg/l、抗氧化剂140-310mg/l，得到所述膜洗涤试剂。
27、相对于现有技术，本发明具有以下有益技术效果：①在试剂盒中增设胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性吸附膜，将待测样本中的c-ast去除，消除测定干扰；②通过增加阴离子交换树脂，去除了待测样本中原始存在的l-天冬氨酸和α-酮戊二酸，降低背景值，提高检测精度。