全血基质的免疫抑制剂冻干品及其制备方法与流程

本发明涉及医学检测，尤其是涉及一种全血基质的免疫抑制剂冻干品及其制备方法。

背景技术：

1、免疫抑制剂是一类抑制免疫相关细胞增殖和功能的药物，它可以降低免疫反应的药物，主要用于预防器官移植中的排斥反应，以及临床上治疗自身免疫性疾病。近年来，多种新型高效低毒的免疫抑制剂已经被开发并应用与临床，但药物的功效和毒副作用与剂量密切相关。因此，要想获得准确的药物浓度，保证药物浓度在安全有效的治疗范围，就需要对体内多种免疫抑制剂浓度进行监测，并合理调整临床剂量的使用。大部分免疫抑制药物存在于各种“载体”分子的复合物中，如血液中约50％的环孢素a被红细胞吸收，30％与血浆脂蛋白等蛋白结合。为了确保准确测量总药物浓度，临床上通常监测全血样本，并在定量前需要用特殊方式处理全血样本，以释放与结合蛋白结合的药物。

2、环孢素a、他克莫司、雷帕霉素等免疫抑制剂在临床上使用广泛，并以液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)作为金标准进行监测。在用液相色谱串联质谱法进行精确监测时，基于全血基质的标准物和质控物可以最大化消除临床全血样本中基质效应所带来的偏差与干扰，然而这种基于全血基质的校准物和质控物通常包括以下几种问题：1.如果基质来源于人类，则存在潜在待测物、病原体、伦理和成本的问题；2.全血中多种细胞能否稳定且均一的存在与制品中；3.多种亲脂免疫抑制剂须同时、均一且稳定的溶解在基质中；4.制备方式须满足产品整体的均一性、稳定性和基质互通性。

3、国内有效专利中最早关于全血制品的公开专利为2006年的cn1873413a，该专利提供一种全血质控物及生产工艺，其组成包括血液、抗凝剂、固定剂及保护剂，主要用于阻抗型血细胞分析仪的血液验证。申请该专利的公司在2019年通过专利cn109238927a重新扩增了保护范围。2016年，专利cn105758700a公开了一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶冻干全血质控品及其制备方法，该方法通过离心人全血制备红细胞溶血液，并作为质控品的基质。专利cn107266563和cn112986065同样通过离心分离细胞加复配添加剂的方法分别介绍了血红蛋白质控品和全血质控品的制备方法。2020年，专利cn111856044a公开了一种全血型冻干粉免疫抑制剂质量控制物质的制备方法和应用，该物质主要是以人全血、免疫抑制剂和其它添加剂配制成的冻干品。国际专利wo/2018/162475(国内专利号：cn110352062a)公开了一种液体免疫调节性大环内酯类的稳定制剂，其包含免疫调节性大环内酯化合物和基本上无细胞的血液溶血物，用于液相色谱串联质谱试剂盒的校准溶液。

4、以上专利中，除国际专利wo/2018/162475外，其它专利制备全血基质产品所使用的基本思路都是：1.混合全血；2.离心分离(或不分离)细胞；3.添加各种增加稳定性的试剂；4.制成冻干产品(或直接液体使用)。使用人全血可能存在内源性检测物、病原体、伦理和成本的问题。使用离心分离细胞可能会减少全血基质中物质的复杂性，这可能会导致产品无法满足基质互通性。此外，即使在全血中添加大量高分子量聚合物，全血中的部分细胞(最大可达20微米)也可能无法长期保持不沉淀不分离，这极大增加了测定时的不均一风险，而且高浓度的聚合物会使溶液变得异常粘稠且难以冷冻干燥和复溶。检测临床全血样本时，必须先裂解细胞释放免疫抑制剂，所以标准品和质控品使用已溶血的全血基质可能并不会影响其发挥基质效应。国际专利wo/2018/162475中就描述了一种通过反复冻融动物全血并添加化合物的方法，制备出了一种无细胞血液溶血物的溶液，用以稳定免疫调节性大环内酯类，然而该无细胞血液溶血物的溶液存在保存时间短，不能长期保存。

5、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种全血基质的免疫抑制剂冻干品，以解决上述问题。

2、本发明的第二目的在于提供上述全血基质的免疫抑制剂冻干品的制备方法。

3、第一方面，本发明提供了一种全血基质的免疫抑制剂冻干品，主要由全血混合液经冷冻干燥后制备得到；

4、所述全血混合液主要由动物全血、助剂和免疫抑制剂组成；

5、所述动物全血中细胞破碎。

6、作为进一步技术方案，所述动物全血包括鼠全血、兔全血、猪全血、牛全血、羊全血或马全血中的一种或多种。

7、作为进一步技术方案，采用冻融处理破碎动物全血中的细胞；

8、所述冻融处理包括如下步骤：

9、a.将动物全血于-20℃至-80℃温度下冷冻6-24小时；

10、b.将a步骤处理后的动物全血于15℃-40℃温度下处理0.5-4小时；

11、c.重复a步骤和b步骤1-3次。

12、作为进一步技术方案，采用珠磨工艺破碎动物全血中的细胞；

13、所述珠磨工艺包括：向动物全血中添加玻璃珠，然后在均质仪上进行震荡处理。

14、作为进一步技术方案，所述助剂包括缓冲溶液、助溶剂、抗氧化剂、抗凝剂、赋形剂或防腐剂中的一种或多种。

15、作为进一步技术方案，每1l动物全血中添加0.01-0.1l的缓冲溶液；

16、每1l动物全血中添加0.01-0.1l的助溶剂；

17、每1l动物全血中添加0.01-0.5g的抗氧化剂；

18、每1l动物全血中添加1-10g的抗凝剂；

19、每1l动物全血中添加0.1-50g的赋形剂；

20、每1l动物全血中添加0.01-0.1g的防腐剂。

21、作为进一步技术方案，所述缓冲溶液包括醋酸钠缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液或good’s缓冲液；

22、所述助溶剂包括甲醇、异丙醇、乙腈、二甲亚砜或四氢呋喃；

23、所述抗氧化剂包括维生素c、维生素e、焦亚硫酸钠、2,6-二叔丁基对甲酚或谷胱甘肽；

24、所述抗凝剂包括edta二钠、edta二钾或肝素；

25、所述赋形剂包括海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、2-羟乙基纤维素或葡聚糖；

26、所述防腐剂包括pc-300、pc-950、bnd-10或nan3。

27、作为进一步技术方案，所述免疫抑制剂包括环孢素a、雷帕霉素或西罗莫司、依维莫司或他克莫司。

28、作为进一步技术方案，所述冷冻干燥包括如下步骤：

29、预冻：将全血混合液以0.1-1℃/h的降温速率从常温降至-50℃至-40℃进行预冻1-3小时；

30、冷冻干燥：采用0.5-1℃/h的升温速率升温至-20至0℃，然后在100-600μbar压力下处理10-14小时；

31、二次干燥：以0.5-1℃/h的升温速率升温至20-40℃进行干燥，干燥时间为5-7小时。

32、第二方面，本发明提供了上述全血基质的免疫抑制剂冻干品的制备方法，包括：将动物全血经过细胞破碎处理后与助剂和免疫抑制剂混合，经冷冻干燥后制备得到全血基质的免疫抑制剂冻干品。

33、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

34、本发明提供了一种全血基质的免疫抑制剂冻干品，其在25℃下可长期存储12个月，该制品复溶迅速且复溶后溶液均一，复溶后在2-8℃冰箱中可稳定3个月。