PREX1、MMP10、BST2和TMEM70在瘢痕疙瘩分子分型或预后中的应用

本发明涉及生物检测，涉及prex1、mmp10、bst2和tmem70作为瘢痕疙瘩标志物的应用，具体涉及prex1、mmp10、bst2和tmem70联合在瘢痕疙瘩分子分型或预后评估中的应用，对瘢痕疙瘩患者进行精准化诊断或预后。

背景技术：

1、瘢痕疙瘩是一种常见的皮肤纤维增生性疾病，是一种良性皮肤肿瘤，通常发生在由遗传或病理因素引起的皮肤损伤之后。目前普遍认为，形成细胞外基质(ecm)的成纤维细胞和肌成纤维细胞是创面愈合重塑及瘢痕疙瘩形成的主要细胞类型，然而创面愈合过程复杂，其中血管生成同样是组织修复的关键。研究表明，血管内皮细胞及其与周围细胞的广泛相互作用似乎在瘢痕的发病过程中起着至关重要的诱导作用，血管内皮细胞的功能异常及其与免疫细胞、纤维化相关细胞的相互作用可能导致异常瘢痕中的炎症和ecm沉积，增加了瘢痕疙瘩形成的风险。虽然已经开发出了各种针对血管生成的瘢痕疙瘩治疗策略，如激光治疗和放射治疗，但它们在降低瘢痕疙瘩的复发率方面收效甚微。因此，我们推测异常的血管调节可能是伤口愈合过程中瘢痕疙瘩发生发展的基础，但这一过程背后的病理机制尚未完全阐明，目前治疗策略仍然缺乏精准的靶向药物。

2、瘢痕疙瘩的形成是多基因作用的结果：bst2基因编码的bst2蛋白可以促进循环晚期内皮祖细胞粘附于受损的内皮细胞，从而促进血管生成；tmem70编码一种线粒体内膜蛋白，可以促进atp合酶质子通道的原位组装，改善创面微环境中的氧含量，可能代表更好的新生血管功能及更少的胶原沉积，从而改善瘢痕预后；mmp10基因编码的mmp10蛋白被证实在参与由vegf诱导的血管新生途径；prex1可编码一种整合趋化信号的rac鸟嘌呤核苷酸交换因子，有研究证实其可能是血管屏障破坏的关键介质，参与肿瘤坏死因子(tnf)-α诱导的内皮屏障功能障碍。

3、综合来看，prex1、mmp10、bst2和tmem70在瘢痕疙瘩的发生发展中可能发挥重要作用。然而，将prex1、mmp10、bst2和tmem70联合起来所起的作用尚不明确，将其作为瘢痕疙瘩新分子分型标志物并指导预后和个性化治疗也未见文献报道。

技术实现思路

1、本发明针对上述问题进行，第一目的在于提供prex1、mmp10、bst2和tmem70联合作为瘢痕疙瘩精细化诊断或预后标志物的应用；第二目的在于提供prex1、mmp10、bst2和tmem70联合在制备瘢痕疙瘩分子分型或预后诊断试剂盒中的应用，该试剂盒将瘢痕疙瘩分成低成熟度血管内皮细胞亚型(lmecs)、中成熟度血管内皮细胞亚型(mmecs)、高成熟度血管内皮细胞亚型(hmecs)。

2、本发明的研究过程如下：

3、发明人通过对公开数据库中瘢痕疙瘩单细胞测序数据及组织测序数据进行整合生物信息学分析，综合血管内皮细胞命运分化相关基因以及临床预后相关差异基因取交集，得到关键血管内皮细胞命运分化相关基因集。进一步发现prex1、mmp10、bst2和tmem70既与血管内皮细胞分化相关，又与瘢痕疙瘩临床结局相关，提示prex1、mmp10、bst2和tmem70的联合应用可指导瘢痕疙瘩的分子分型。

4、接下来，进行差异基因表达分析构建新的瘢痕疙瘩分子分型：低成熟度血管内皮细胞亚型(lmecs)、中成熟度血管内皮细胞亚型(mmecs)、高成熟度血管内皮细胞亚型(hmecs)，结果显示：mmp10、bst2和tmem70在lmecs中明显高表达，prex1在hmecs中明显高表达，bst2在mmecs中显著低表达；临床相关性分析结果证实：hmecs对应临床预后最差，而lmecs对应临床预后最好。

5、进一步对临床手术切除的瘢痕疙瘩进行免疫组织化学染色，结果发现mmp10、bst2和tmem70在预后好患者中病理打分最高，prex1在预后最差患者中病理打分最高，bst2在预后中等患者中打分最低。以上结果提示prex1、mmp10、bst2和tmem70的联合应用可指导瘢痕疙瘩的分子分型。

6、与此同时，本发明对免疫组织化学染色病理打分及患者临床病理特征及预后进行临床相关性打分，结果发现hmecs分型的瘢痕疙瘩伴随更多的疼痛、瘙痒、颜色异常、血管异常及更高的温哥华瘢痕评估量表(vss)得分和更高的复发率，表明病人预后更差，提示prex1、mmp10、bst2和tmem70的联合应用可用于瘢痕疙瘩的预后评估。

7、基于上述研究，本发明的具体技术方案如下：

8、本发明第一方面，提供了检测联合蛋白组的试剂在制备瘢痕疙瘩分子分型或预后试剂或试剂盒中的应用，其中，该联合蛋白组为prex1、mmp10、bst2和tmem70蛋白联合。

9、优选的，所述的瘢痕疙瘩分子分型或预后试剂为检测生物样品中prex1、mmp10、bst2和tmem70表达量的试剂；瘢痕疙瘩分子分型或预后试剂盒包含了检测生物样品中prex1、mmp10、bst2和tmem70表达量的试剂。

10、根据生物样品中prex1、mmp10、bst2和tmem70的表达量，将瘢痕疙瘩分成低成熟度血管内皮细胞亚型(lmecs)、中成熟度血管内皮细胞亚型(mmecs)、高成熟度血管内皮细胞亚型(hmecs)。其中，mmp10、bst2和tmem70在低成熟度血管内皮细胞亚型中明显高表达，prex1在高成熟度血管内皮细胞亚型中明显高表达，bst2在中成熟度血管内皮细胞亚型中显著低表达。

11、进一步优选，检测生物样品中prex1、mmp10、bst2和tmem70蛋白表达量的试剂选自采用免疫组化方法进行检测的试剂。

12、进一步优选，所述生物样品获自对象的皮肤组织，具体为病人瘢痕疙瘩的石蜡包埋组织。

13、本发明的第二方面，提供了一种瘢痕疙瘩分子分型或预后试剂盒，该试剂盒包含了检测生物样品中prex1、mmp10、bst2和tmem70表达量的试剂。

14、优选的，该试剂盒为采用免疫组化方法进行检测的试剂盒，包含特异性识别人prex1的抗体、特异性识别人mmp10的抗体、特异性识别人bst2的抗体、特异性识别人tmem70的抗体及免疫组化实验试剂。

15、本发明的第三方面，提供了上述用于检测瘢痕疙瘩组织中prex1、mmp10、bst2和tmem70试剂盒的检测方法，具体步骤如下：

16、1、脱蜡至水

17、(1)4μm厚石蜡切片，每个瘢痕疙瘩组织4张连续切片，60℃烤箱烤1h；

18、(2)二甲苯处理10min×3次；

19、(3)依次经过100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇、双蒸水洗，各5min。

20、2、抗原修复

21、(1)含3％h2o2的甲醇溶液处理20min；

22、(2)双蒸水洗5min×3次；

23、(3)抗原修复(高压修复)：

24、切片放入盛有edta碱性修复液(2mm edta、2mm na2hpo4)的高压锅中，高压煮沸2min，自然冷却至室温。

25、3、一抗孵育

26、(1)pbs洗5min；

27、(2)50μl 1％bsa覆盖组织，37℃封闭30min；

28、(3)吸去封闭液，4张连续切片分别滴加按比例稀释后prex1、mmp10、bst2或tmem70一抗50μl，湿盒中4℃孵育过夜。

29、4、二抗孵育

30、(1)吸走一抗，pbs洗5min×4次；

31、(2)滴加50μl按比例稀释后带hrp标记的二抗，37℃孵育30-45min；

32、5、显色、反蓝

33、(1)pbs洗5min×4次；

34、(2)dab(1:50)显色3-10min，至出现砖红色沉淀，双蒸水终止显色；

35、(3)苏木素复染10min，盐酸酒精分化后自来水冲洗反蓝20-30min。

36、6、脱水封片

37、依次经过双蒸水、75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇、石炭酸、二甲苯处理各5min，滴加树脂封片。

38、7、分析

39、显微镜下判读prex1、mmp10、bst2和tmem70的表达得分。

40、本发明的有益保障及效果：

41、本发明提供了联合prex1、mmp10、bst2和tmem70作为瘢痕疙瘩新分子分型标志物，尤其为瘢痕疙瘩的预后评估及个性化治疗提供了重要指导。通过对临床手术切除的瘢痕疙瘩进行免疫组织化学染色，结果发现mmp10、bst2和tmem70在预后好患者中病理打分最高，prex1在预后差患者中病理打分最高，而hmecs分型的瘢痕疙瘩伴随更多的疼痛、瘙痒、颜色异常、血管异常及更高的温哥华瘢痕评估量表(vss)得分和更高的复发率，病人预后更差。以上结果提示prex1、mmp10、bst2和tmem70的联合应用可指导瘢痕疙瘩的分子分型或预后评估。本发明针对瘢痕疙瘩提供了精细化诊断或预后，为其个性化治疗提供了基础，具备广阔的临床应用前景。