一种基于受体检测胶原蛋白整合素功能域的试剂盒及其制备与应用的制作方法

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种基于受体检测胶原蛋白整合素功能域的试剂盒及其制备与应用。

背景技术：

1、近年来，随着人们对胶原蛋白结构和功能等研究的不断深入，基于胶原蛋白产品在世界范围内的需求快速增长。胶原蛋白在食品、保健食品及化妆品等领域的应用已十分广泛。胶原蛋白在医疗领域的应用，如敷料、植入材料以及组织工程医疗产品等也日益增长。胶原蛋白是结缔组织的主要蛋白成分，是与机体的细胞、组织和器官功能息息相关的功能性蛋白，具有良好的生物相容性和生物可降解性，同时具有如高拉伸强度、低免疫性、止血性能以及促进细胞生长等性能。

2、重组胶原蛋白是指由dna重组技术制备的，含有人胶原蛋白特定类型基因编码的全长或部分基因序列的重组蛋白，或是含有人特定类型或不同类型胶原蛋白基因编码的部分序列，经基因编辑、组合、拼装、剪辑等制备的人胶原蛋白类似物，或是含有人特定或不同类型胶原蛋白部分基因编码及人工设计的基因编码，经基因编辑、组合、拼装等制备的胶原蛋白类似物，具有胶原蛋白或与胶原蛋白相似的理化性质和生物学功能。胶原蛋白分子纯度和完整性(包括功能区)是其聚合能力以及自组装产物的微观结构、物理和生物特性的关键决定因素。

3、随着胶原蛋白市场的快速发展，产品质量参差不齐，对其鉴定和检测的需求也快速增长，目前检测胶原蛋白产品的方法主要有：sds-page凝胶电泳、紫外光谱等可以鉴定胶原蛋白种类及纯度，高效液相-质谱联用法、羟脯氨酸比色法、免疫学检测法等可以对胶原蛋白进行定量检测，圆二色谱、傅里叶红外光谱、拉曼光谱等可以对胶原蛋白的结构进行检测。公开号为cn115586340a的中国发明专利公开了一种天然活性胶原蛋白快速鉴定试剂盒，能够快速定性检测具有完整三螺旋结构的活性胶原蛋白。市场上许多胶原蛋白产品声称其具有保湿、美白、抗衰老等的生物活性，但现有技术中还没有一种检测方法能够快速检测或辅助检测胶原蛋白产品的生物学功能。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供一种基于受体检测胶原蛋白整合素功能域的试剂盒及其制备方法，通过快速检测是否含有整合素功能域来辅助判定胶原蛋白是否具备相关功效。

2、本发明的第一个目的是提供一种胶原蛋白功能域检测试剂盒，所述试剂盒包含试纸条，所述试纸条包含标记整合素和整合素抗体。

3、优选地，所述标记整合素为金标整合素。

4、优选地，所述整合素抗体为整合素β1多克隆抗体。

5、优选地，所述标记整合素为金标整合素和所述整合素抗体为整合素β1多克隆抗体。

6、优选地，所述试纸条包括pvc底板，所述pvc底板上从左到右依次搭接样品垫、金垫、硝酸纤维素膜(nc膜)和吸水纸。所述金垫上固定有金标整合素，所述nc膜上按层析方向依次包括检测线(t线)和质控线(c线)，所述t线包被有含整合素结合域的重组胶原蛋白，所述c线包被有整合素β1多克隆抗体。

7、在一优选例中，所述标记整合素为金标整合素，并且所述试剂盒的制备步骤如下：

8、s1、胶体金的制备：

9、去离子水和氯金酸溶液，搅拌、煮沸，然后移取柠檬酸钠溶液快速加入烧瓶中，继续搅拌至溶液恢复到室温，然后将胶体金溶液用去离子水定容，备用。

10、s2、金标整合素的制备

11、加入上述胶体金溶液搅拌，移取k2co3溶液逐滴加入至胶体金溶液内搅拌，再向溶液中加入整合素，加入bsa溶液搅拌封闭，离心，然后吸去上清，用复溶液(含蔗糖、bsa、tween-20、防腐剂的tris-hcl缓冲液)将沉淀复溶即得。

12、s3、金垫的制备：

13、用含bsa、tween-20、防腐剂、蔗糖的tris-hcl缓冲液涂布于玻璃纤维上烘干，然后将金标整合素喷涂在经处理的玻璃纤维上烘烤。

14、s4、硝酸纤维素膜的制备：

15、用含bsa的pbs缓冲液作为包被缓冲液，将含整合素结合域的重组胶原蛋白包被在nc膜上作为t线，将整合素β1多克隆抗体用包被缓冲液稀释包被在nc膜上作为c线，烘干即得。

16、s5、样品垫的制备：

17、用含pvp、tween-20、防腐剂、蔗糖的tris-hcl缓冲液涂布于玻璃纤维上，烘干即得所述样品垫。

18、s6、试纸条的制备：

19、在pvc底板上从左到右依次搭接步骤s5中的样品垫、步骤s3中的金垫、步骤s4中的硝酸纤维素膜和吸水纸，裁切成所需宽度即得所述试纸条；

20、s7、试剂盒的制备：在湿度＜30％rh环境中将所述试纸条装入卡内槽中，配套有瓶装样品稀释液及说明书。

21、优选地，步骤s1中所述胶体金为万分之四胶体金、粒径大小为40nm，所述氯金酸溶液的质量百分比为10％、柠檬酸钠溶液的质量百分比为10％，制备100ml所述胶体金所用氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液分别为1.2ml和3.84ml。

22、优选地，步骤s2中所述k2co3溶液浓度为0.2m，所述整合素加入量为4～10μg/ml胶体金，所述bsa溶液加入后bsa终浓度为0.5％～2％，所述复溶液含1％～5％(w/v)蔗糖、0.5％～2％(w/v)bsa、0.05％～2％(v/v)tween-20、0.04％～1％(v/v)防腐剂，所述防腐剂为proclin 300，所述tris-hcl缓冲液浓度为0.02～0.1m，ph为7.0～9.0。

23、优选地，步骤s3中所述金垫预先用含1％～5％(w/v)蔗糖、0.05％～0.2％(v/v)tween-20、0.05％～0.2％(w/v)bsa、0.04％～0.1％(v/v)防腐剂，浓度为0.02～0.1m、ph为7.0～9.0的tris-hcl缓冲液处理玻璃纤维并烘干，然后用所述标记整合素按喷量1.0～5.0μl/cm喷涂在经烘干的玻璃纤维上烘烤即得，所述防腐剂为proclin 300。

24、优选地，步骤s3中所述喷涂的过程为：将该复合物吸入到喷金划膜仪中，喷金划膜仪设置喷涂量为3.0μl/cm，喷涂速度为100mm/s，喷涂后在40℃、＜30％rh的环境下烘干12～24h即得所述金垫。

25、优选地，步骤s4中所述包被缓冲液为含0.05％～2％(w/v)bsa、浓度为0.01～0.1m、ph为7.0～9.0的pbs缓冲液，所述重组胶原蛋白用包被缓冲液稀释至0.1～2mg/ml作为t线包被液，所述整合素β1多克隆抗体用包被缓冲液稀释至0.1～2mg/ml作为c线包被液，所述t线包被液和c线包被液包被量为0.8～2μl/cm。

26、优选地，步骤s5中所述样品垫用含1％～5％(w/v)蔗糖、0.05％～0.2％(v/v)tween-20、0.05％～2％(w/v)pvp、0.04％～0.1％(v/v)防腐剂，浓度为0.02～0.1m、ph为7.0～9.0的tris-hcl缓冲液处理玻璃纤维并烘干即得，所述防腐剂为proclin 300。

27、步骤s7中，所述样品稀释液优选为含tween-20、proclin 300的tris-hcl缓冲液；所述样品稀释液更优选为含0.05％～0.2％(v/v)tween-20、0.04％～0.2％(v/v)proclin300、浓度0.02～0.2m、ph为7.0～9.0的tris-hcl缓冲液；所述样品稀释液最优选为含0.1％(v/v)tween-20、0.04％(v/v)proclin 300、浓度0.05m、ph为8.0的tris-hcl缓冲液。

28、本发明所述整合素包括但不限于：整合素α1β1、α2β1、α10β1和α11β1。

29、本发明的第二个目的是提供上述试剂盒的应用，所述的试剂盒在检测胶原蛋白功能域从而辅助检测胶原蛋白生物学功能中的应用。

30、更优选地，所述的胶原蛋白为重组胶原蛋白。

31、本发明具有如下优势：填补了胶原蛋白产品生物学功能检测领域的空白；本发明试剂盒制备成本低廉且最快5分钟即可获得结果；本发明试剂盒对于胶原蛋白产品研发生产、质量控制、检测评价都具有重要意义。

32、为实现本发明的目的，发明人同时进行了夹心法和竞争法的试剂研发。夹心法采用胶原蛋白抗体用于t线包被，竞争法则采用含整合素功能域的胶原蛋白进行t线包被。考虑到业内重组胶原蛋白大部分为人胶原蛋白片段且不同厂家为实现不同宣传功能采用的片段位置和大小各不相同，但胶原蛋白抗体仅可与特定的免疫位点结合从而无法应对所有类型的重组胶原蛋白，故容易产生假阴性，竞争法只需胶原蛋白含有整合素功能域即可有效避免该设计缺陷。