一种单片烤烟叶不同部位化学成分的半定量测量方法与流程

本发明属于烟草分析化学研究领域，具体涉及一种单片烤烟叶不同部位化学成分的半定量测量方法。

背景技术：

1、烟草化学成分是决定烟草品质的基本物质，这些成分在烟叶的不同区域内存在显著差异。为了更好地了解烟草化学成分的迁移和合成机制，以及在烟草工业中进行精确的复烤和叶组配方设计等，在获得烟叶化学成分的基础上，需要进一步研究单片烟叶中化学成分的空间分布，这可为烟草农业生产和烟草工业的发展提供重要的参考和指导。

2、目前，研究烟草植物叶片化学成分空间分布的常规质谱分析法是基于气相色谱质谱联用(gc-ms)或液相色谱质谱联用(lc-ms)进行分析，先将烟草叶片按一定标准进行分区或分段后切丝处理，适当烘干，然后磨粉；按不同区段分别准确称取一定量的粉末，加入合适比例溶剂，振动、萃取，获得若干个烟叶不同区段的萃取液，再基于气相色谱质谱联用仪(gc-ms)或液相色谱质谱联用仪(lc-ms)对萃取液进行分批测试，整理出不同烟叶区段对应的化学成分与相对含量关系，即得到烟草植物叶片的化学成分空间分布。但是，此方法的前处理繁琐复杂，必须将固体烟叶样本处理为样品溶液，参与反应物质需充分混合、相关化学反应达到平衡后才能进行准确测试,且需要分批进行色谱分离，非常耗时冗长。

3、质谱成像分析技术是一种通过映射分子在空间中分布的新颖技术，通过将质谱扫描和可视化成像软件相结合，既能够对细胞或者组织中的分子进行定性和原位可视化分析，又能通过标准曲线法等对样品中的待测物进行定量分析，从而确定样品组织中目标分子的分布和含量。解吸电喷雾和二次光电离质谱成像(desi/pi-msi)技术是基于解析电喷雾电离(desi)质谱成像发展起来的，它将大气压真空紫外光电离pi与desi离子源结合，改善了解析电喷雾电离质谱成像受基质干扰明显、存在电离极性歧视现象等缺陷，实现了同时对生物组织表面多种极性和非极性化合物进行分析和成像。目前，已成功应用于多种新鲜植物叶片样本中，实现各种离子的可视化，并且可进行定性定量分析。与气相色谱质谱联用技术与液相色谱质谱联用技术相比解吸电喷雾和二次光电离质谱成像技术具有样品前处理简单，一次实验可获得样品多个区段的同时分析，并且直观地展示化学成分在样品表面的空间分布信息，从而实现测量样本不同部位化学成分的半定量。解吸电喷雾和二次光电离质谱成像技术的发展为研究烟草植物叶片化学成分空间分布提供了新的思路，但由于初烤干烟叶样本本身具有较厚的角质层和表面蜡质层，并且相较于新鲜植物叶片样本水分含量十分的少，因此很难对初烤干烟叶样本直接进行质谱成像。

技术实现思路

1、为了实现对初烤干烟叶的直接进行质谱成像，本发明提供一种单片烤烟叶不同部位化学成分的半定量测量方法。

2、本发明为实现目的，采用如下技术方案：

3、一种单片烤烟叶不同部位化学成分的半定量测量方法，操作步骤如下：

4、(1)初烤干烟叶样本前处理

5、(1.1)将烟叶放入恒温恒湿箱中平衡6小时，将烟叶铺展开；

6、(1.2)选取单片烟叶中的三个以上的目标区域，采用圆形打孔器在每个目标区域内截取出三个烟叶的圆片；

7、(1.3)将截取的三个以上目标区域的烟叶圆片置于恒温恒湿箱中平衡12小时，得到湿度一致圆片；

8、(1.4)将湿度一致圆片一起摆放在一块多孔的聚四氟乙烯(ptfe)板上，并在湿度一致圆片的上方覆盖几层薄纸，将两块铝板分别放置在薄纸上方和聚四氟乙烯板下方，采用压片机在铝板上逐渐施加压力，使三个以上目标区域的湿度一致圆片在多孔的聚四氟乙烯板表面留下烟叶圆片的汁液印迹；

9、(1.5)将带有所述汁液印迹的聚四氟乙烯板粘于载玻片上；

10、(2)利用解吸电喷雾和二次光电离质谱成像(desi-pi-msi)技术测试

11、(2.1)将载有所述汁液印迹的聚四氟乙烯板的载玻片放置在解吸电喷雾和二次光电离质谱成像装置的二维精密电控移动平台上；

12、(2.2)在解吸电喷雾和二次光电离质谱成像装置中，通过利用雾化气将雾化溶剂喷射到汁液印迹表面的操作下，对待测汁液进行解析；解析出的化合物进入光电离室，利用掺杂剂进行辅助光电离，离子化的化合物进入质谱仪被检测分析，通过得到的质谱数据获得质谱图；

13、(2.3)通过成像软件提取质谱图中的在三个以上目标区域的烟叶圆片汁液印迹中所测化合物的空间分布信息和分子信号强度，再分别提取所测化合物在三个以上目标区域烟叶圆片中的单位面积平均信号强度，并计算出在每个目标区域中三个烟叶圆片的平均信号强度值；

14、(2.4)以选取的三个以上目标区域的位置点(x)为横坐标，以每个目标区域位置点中三个烟叶圆片区域的单位面积平均信号强度(y)为纵坐标，采用origin软件作出折线图，分别获得烟叶上三个以上目标区域的化合物的含量分布数据。

15、进一步限定的技术方案如下：

16、步骤(1.2)中，所述目标区域的面积为1cm×1cm。

17、步骤(1.2)中，所述圆片的直径为3mm。

18、步骤步骤(1.1)与(1.3)中，所述恒温恒湿箱条件，温度为22℃、相对湿度为70％。

19、步骤(1.4)中，所述压片机的施加压力为4mpa。

20、步骤(2.2)中，所述喷雾溶剂由甲醇、甲苯和甲酸按体积比70:30:0.1混合均匀制成；喷雾溶剂流速为3μl/min，喷雾电压是3500v；所述雾化气为氮气，雾化气压力为1.3mpa。

21、步骤(2.2)中，所述掺杂剂为甲苯。

22、步骤(2.2)中，在解吸电喷雾和二次光电离质谱成像装置中，光电离装置取样管以15°的倾斜角度使取样端口对应着聚四氟乙烯板上的汁液印迹，打开氪直流放电真空紫外灯，开启雾化器，雾化溶剂在雾化气的辅助下将高速带电液滴喷射到汁液印迹表面，对待测汁液进行解析；解析出的化合物通过光电离装置取样管到达光电离室，在光电离室中利用掺杂剂进行辅助光电离，离子化的化合物进入质谱被检测分析，通过获得质谱数据制得质谱图，质谱图体现了三个以上目标区域的烟叶圆片的汁液印迹中测出的所有化合物的确定分子量与分子信号强度。

23、步骤(2.3)中，所有质谱数据首先使用msconvert软件进行第一部转化，然后再使用imzmlconverter软件将转化后的所有文件整合为一个imzml文件，将imzml文件导入msireader成像软件中，进行质谱成像图的查看和提取，获得的质谱成像图反应了所测化合物在三个以上目标区域的烟叶圆片的汁液印迹中的空间分布信息与信号强度信息，利用成像软件中手动定义感兴趣的区域功能，在三个以上目标区域的烟叶圆片的汁液印迹中分别提取所测化合物在烟叶圆片中的单位面积的平均信号强度值，进行记录，并计算出每个目标区域的三个烟叶圆片区域的平均信号强度值。

24、与已有技术相比，本发明的有益技术效果体现在以下方面：

25、1.本发明对初烤干烟叶的前处理过程简单，并且无需使用任何有机溶剂。即先对初烤干烟叶进行恒温恒湿平衡6小时，局部裁剪后，对初烤干烟叶再次恒温恒湿平衡12小时后，一起摆放在一块多孔聚四氟乙烯板上，进行植物印迹操作。

26、2.本发明利用解吸电喷雾和二次光电离质谱成像技术进行测试，一次测试可获得初烤干烟叶多个目标区域的同时分析，快速准确。参见图1，如图1小方框所示烟叶样本纵向区域的选取是沿叶尖到叶基纵向近等距离选取8个区域，可同时进行分析。

27、3.直观地展示化学成分在样品表面的空间分布信息，从而实现测量样本不同部位化学成分的半定量。参见图3，图3为在正离子模式下检测到烟叶中12种代表性化学物质的质谱成像图，通过颜色变化可以清楚的观察每种物质从叶尖到叶基处的含量变化。