一种猫IgG的Fc段生物学活性测定方法与流程

本发明涉及动物免疫球蛋白制品的生物学活性检测，尤其涉及一种猫igg的fc段生物学活性测定方法。

背景技术：

1、免疫球蛋白具有抗体活性的动物蛋白，主要存在于血浆中，也见于其他体液、组织和一些分泌液中。免疫球蛋白是机体受抗原(如病原微生物)刺激后产生的，其主要作用是与抗原产生免疫反应，生成抗原-抗体复合物，从而阻断病原体对机体的危害，使病原微生物失去致病作用。

2、人血浆内的免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白中，可分为五类，即免疫球蛋白g(igg)、免疫球蛋白a(iga)、免疫球蛋白m(igm)、免疫球蛋白d(igd)和免疫球蛋白e(ige)，其中igg是最主要的免疫球蛋白。igg分子由4条肽链组成，包含轻链和重链，轻链与重链之间通过二硫键相连接。

3、igg是典型的“y”字结构，包含fab段和fc段，fab段的可变区与相应抗原决定簇的立体构型吻合，才能结合。抗体fab段与相应抗原结合后，igg的fc段变构，其重链恒定区上的补体结合点暴露，c1q遂与之结合，从而使补体各成分激活，产生其他生物学活性，此称为补体激活的经典途径。

4、静脉丙种球蛋白(intravenous immunoglobulin，ivig)是指来自富含igg制剂的血制品，最初用于低igg的替代治疗。1982年who要求ivig制剂中fc相关功能(激活补体和结合fc受体的功能)不受影响。所以，国外很早就已经建立了ivig制剂fc段相关功能的检测方法。《欧洲药典》均收载有人igg的fc段生物学活性测定方法，其方法中用的红细胞为人“o”型血，抗原为风疹病毒。在我国，王菁舟等在2003年首先在国内建立了ivig的fc段激活补体检测方法，并将人igg的fc段生物学活性测定法始收载于2010年《中国药典》，其方法中用的红细胞为人“o”型血，抗原为白喉类毒素或腮腺炎病毒。

5、目前，有关人ivig制剂中fc段生物学活性测定方法已在人类医学中得到验证，人igg的fc段生物学活性测定的原理为：依据特异性抗体(免疫球蛋白)fab段与红细胞上包被的相应抗原结合，抗体暴露出fc段补体c1q的结合位点，从而激活后续的补体各成分，最终导致红细胞的细胞膜受到攻击、破裂，释放出血红蛋白。再通过溶血反应动力学曲线，计算免疫球蛋白激活补体活性的功能指数。然而，关于动物igg的fc段生物学活性未有研究报道。由于种属特性等各种原因，《中国药典》和《欧洲药典》收载的人免疫球蛋白igg fc段生物学活性测方法并不能适用于动物来源的制品检测。

6、本研究的供试品为静注猫免疫球蛋白(ph4)，其主要成分为猫igg。为建立猫igg的fc段生物学活性的测定方法，首先对猫红细胞、绵羊红细胞进行筛选，抗原的选择应该考虑供试品中针对此种抗原的特异性抗体滴度水平，根据猫的免疫程序，选择猫细小病毒(feline parvovirus，fpv)、猫杯状病毒(feline calicivirus，fcv)、猫疱疹病毒(felineherpesvirus，fhv)以及fcov是猫冠状病毒(feline coronavirus)四种抗原进行试验，抗原确定后，对供试品中针对此种抗原的特异性抗体确定。因此，通过对上述关键因素的筛选开发出一种适合猫igg的fc段生物学活性的测定方法。此外，药典中使用的巴比妥钠属于dea管制类化学品(禁售)，因此也需要仔细斟酌研究进而选用其它的化学试剂进行代替，以保证试验能顺利开展。

技术实现思路

1、本发明目的是提出一种猫igg的fc段生物学活性测定方法。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、本发明提出的猫igg的fc段生物学活性测定方法，以绵羊红细胞为致敏红细胞，以猫冠状病毒为致敏红细胞抗原，将鞣化后红细胞与氯化铬连接，用猫冠状病毒致敏红细胞，通过抗原抗体的特异性反应，暴露出猫igg的fc段补体c1q的结合位点，加入补体后激活补体反应，导致红细胞膜的破裂，引起溶血；再通过溶血反应动力学曲线，计算猫igg的fc段激活补体功能指数，猫igg的fc段激活补体功能指数≥70％。

4、进一步地，供试品中抗猫冠状病毒中和抗体效价抗体为1:64以上。

5、进一步地，用牛血清白蛋白-tris(at)缓冲液进行致敏后红细胞的处理。

6、进一步地，猫冠状病毒的病毒含量应不低于108.00tcid50/ml。

7、进一步地，猫igg的fc段生物学活性测定方法，包括以下步骤：

8、s1、红细胞的处理：

9、静脉采集健康动物的血液至装有阿氏液的无菌管中，用pbs洗涤后离心分离红细胞，用pbs制备成2％的细胞悬液；

10、s2、红细胞的鞣化：

11、取鞣酸溶液与等体积的2％红细胞悬液混匀，放于37℃水浴中鞣化30分钟，用pbs洗涤后用pbs制备成1％的红细胞悬液；

12、s3、红细胞的致敏反应：

13、取猫冠状病毒与0.5％氯化铬溶液按照体积比1：0.125混匀后，置37℃水浴中静置反应15分钟，得到联结铬的抗原；

14、取1％的红细胞悬液，加入联结铬的抗原混匀，置37℃水浴反应30分钟，每隔10分钟混匀一次；离心去上清，用pbs洗涤沉淀，用at缓冲液悬浮红细胞，取红细胞悬液用at缓冲液调节浓度，使其在541nm处的吸光度值为1.0±0.1，即为致敏红细胞悬液；

15、s4、供试品溶液的制备：

16、用饱和碳酸氢钠溶液将供试品ph值调至6.8～7.0，供试品中抗猫冠状病毒中和抗体效价抗体为1:64以上；再用at缓冲液将供试品igg浓度稀释至每1ml含20mg；

17、s5、抗原抗体反应：

18、取供试品溶液7ml，加致敏红细胞悬液1ml混匀，置37℃水浴反应30分钟，每隔10分钟混匀一次；离心去上清，用at缓冲液洗涤沉淀；向红细胞沉淀中加入0.7ml at缓冲液重悬红细胞，混匀后置37℃水浴中反应6分钟，每10s混一次；

19、s6、测定法：

20、抗原抗体反应完成后，取200μl红细胞悬液放入酶标板中，加入已稀释至每1ml含100ch50的补体100μl，混匀10秒，立即放入酶标仪中在541nm处测定起始吸光度值as，之后每隔1分钟测定1次，即得供试品在波长541nm处的吸光度与时间的溶血反应动力学曲线；当吸光度值越过了曲线的内曲点后即停止测量；取7ml at缓冲液作为阴性对照，替换步骤s5中供试品溶液并重复步骤s5和s6，测定吸光度值；

21、s7、供试品激活补体功能指数确定：

22、以测定时间为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制溶血反应动力学曲线图，当吸光度值越过了曲线的内曲点后即可停止测量，计算供试品激活补体功能指数，通过供试品的激活补体功能指数确定猫igg的fc段生物学活性。

23、进一步地，步骤s1中，pbs的ph为7.2，配制方法为：称取无水磷酸氢二钠1.02g、无水磷酸二氢钠0.34g、氯化钠8.77g，加适量水溶解，用1mol/l氢氧化钠溶液或盐酸溶液调ph值至7.2，再加水稀释至1000ml。

24、进一步地，步骤s2中，鞣酸溶液的配制方法为：称取鞣酸1mg，加ph7.2pbs10ml，使溶解得到a液；量取a液0.1ml，加ph7.2 pbs 7.5ml，混匀，即得鞣酸溶液。

25、与现有技术相比，本发明的技术效果：

26、本发明基于igg fc段生物学活性测定的原理，先对不同种属的红细胞进行筛选，然后根据猫的免疫程序对抗原进行筛选，再根据抗原确定静注猫免疫球蛋白(ph4)针对此种抗原的中和抗体水平。通过对以上不同关键指标的筛选，确定一种适合猫igg生物学活性的测定方法。

27、本发明提出的猫igg的fc段生物学活性测定方法，以绵羊红细胞为载体，以猫冠状病毒为抗原，将鞣化后红细胞与氯化铬连接，用猫冠状病毒致敏红细胞，通过抗原抗体的特异性反应，暴露出猫igg的fc段补体c1q的结合位点，加入补体后激活补体反应，导致红细胞膜的破裂，引起溶血。通过检测激活补体功能可确定静注猫免疫球蛋白(ph4)的igg生物学活性。通过溶血反应动力学曲线，计算猫igg的fc段激活补体功能指数，试验确定猫igg fc段激活补体功能指数≥70％，高于静注人免疫球蛋白(ph4)的≥60.0％的标准。

28、本发明通过比较，以at缓冲液代替牛血清白蛋白-巴比妥缓冲液(abb)用于致敏后红细胞的处理，并通过重复性试验和精密度试验对所建立的方法进行验证。经方法学证明所建立的方法重复性良好，具有可操作性。

29、本发明成功建立了猫igg的fc段生物学活性的测定方法，通过该方法的建立，确定不同动物igg生物学活性测定方法的关键点，如红细胞的选择、抗原的选择、抗原的中和抗体水平等，也为其它动物igg生物学活性测定方法的研究提供研究思路。