一种基于非靶向代谢组学鉴别牧草根际分泌物及其差异代谢物的方法

本发明属于分析检测，具体涉及一种基于非靶向代谢组学鉴别牧草根际分泌物及其差异代谢物的方法。

背景技术：

1、人工种植优质牧草是畜牧业提质增效的重点之一。人工栽培草地，如紫花苜蓿等豆科牧草，一般情况下每公顷可产干草4500～15000kg，禾本科牧草可产5000kg左右。建设优质高产稳产牧草生产基地，种植以利用营养体为主的优质牧草，不仅可以解决饲草料不足的问题，也将有效缓解天然草地的放牧压力，使其发挥应有的生态功能，进而推进现代畜牧业进程，促进农业生态系统的可持续发展。

2、根际作为植物根系与土壤间物质交换和能量流动的直接界面，是微生物和无脊椎动物栖息的重要区域。根际分泌物包含植物根系分泌物和土壤微生物分泌物，是植物与微生物、植物与土壤交流的主要媒介，对于根际元素活化与循环、植物养分吸收与利用以及根际微生物群落招募与塑造等均有重要作用。植物根际有益微生物主要有促生微生物和生防微生物两类，而植物主要通过根际分泌物影响根际的微生物群落结构，进而提高养分利用效率和植物的抗病性和抗逆性。因此，对不同牧草的根际土壤中分泌物的组成进行全面、系统地研究是十分必要的。

3、目前国内外对于牧草根际分泌物成分的研究主要集中一种或一类化合物上，因此亟需对牧草根际土壤中分泌物的成分进行全面、深入的结构鉴定，为开发利用根际分泌物和根际微生物以提高牧草产量、改善牧草品质以及加强牧草抗病虫害能力提供科学的理论依据。

技术实现思路

1、为了更深入全面地了解牧草根际土壤中分泌物的成分和鉴别不同牧草根际差异性代谢物，本发明提供一种基于非靶向代谢组学鉴别牧草根际分泌物及差异代谢物的方法，该方法基于高效液相色谱-三重四极杆离子阶质谱采集质谱数据，并对代谢产物进行定性及相对定量分析，其不仅极大地丰富了对根际代谢物成分的认识，也为开发利用根际分泌物和根际微生物以提高牧草产量、改善牧草品质以及加强牧草抗病虫害能力提供科学的理论依据。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供一种基于非靶向代谢组学鉴别牧草根际分泌物及差异代谢物的方法，包括如下步骤：

4、s1、收集不同牧草的根际土壤；

5、s2、向所述根际土壤中加入溶剂，经涡旋震荡、静置、离心后收集上清液并冻干；再次加入溶剂复溶，涡旋震荡，离心后吸取上清液；将所得不同牧草对应的上清液混合，制成质量控制(qc)样本溶液；

6、s3、采用超高效液相色谱和高分辨率串联质谱仪在多反应检测模式下对所述质量控制样本溶液进行检测；

7、s4、在获得不同样本的根际代谢物的质谱数据后，通过proteo wizard软件、cd3.1搜库软件和r软件对不同样本进行峰对齐和保留时间的校正；再将所述校正后的质谱数据与mzcloud(https://www.mzcloud.org/)、mzvault和masslist数据库进行比对，得到不同牧草的根际代谢物的鉴定和相对定量结果；

8、s5、将所述不同牧草的根际代谢物的鉴定和相对定量结果数据进行多元统计分析，结合学生氏t检验，以变量重要性投影指标为筛选指标，筛选出不同牧草的差异性代谢物。

9、步骤s1中，所述牧草的来源地包括但不限于温室种植或田间栽培的各种牧草品种。

10、所述牧草包括豆科牧草和禾本科牧草。

11、所述豆科牧草的采集时期为现蕾期，所述禾本科牧草的采集时期为抽穗期。

12、所述豆科牧草包括但不限于紫花苜蓿(medicago sativa)和白三叶(trifoliumrepens)。

13、所述禾本科牧草包括但不限于鸭茅(dactylis glomerata)和多年生黑麦草(lolium perenne)。

14、步骤s1中，所述收集按照下列步骤进行：将牧草连根从土中取出，用抖土法抖落附着在根系表面的多余土壤，再用软毛刷仔细刷下紧密附着于根系的根际土壤，混合均匀并去除根毛，并于零下80℃保存。

15、步骤s2中，所述溶剂为体积分数60-80％的甲醇溶液。优选地，初溶溶剂为体积分数80％的甲醇溶液，复溶溶剂为体积分数60％的甲醇溶剂。

16、所述根际土壤与所述溶剂的质量体积比为(1-1.5)g：1ml，优选为1g：1ml。

17、所述静置的条件为：冰浴，时间为5-10min，优选为5min。

18、所述离心的条件为：温度为3-5℃，优选为4℃，离心力为15000-18000g，优选为15000g，时间为15-20min，优选为20min。

19、所述混合为所述不同牧草对应的上清液等体积混合，如每种牧草的根际代谢物按照体积100μl混合。

20、步骤s3中，所述检测的条件包括液相色谱条件和质谱条件；

21、所述液相色谱条件为：

22、色谱柱：hypesilgoldcolumn(c18)柱，2.1mm×100mm，1.9μm；

23、正模式流动相：含0.1％的甲酸水溶液a和甲醇b；

24、负模式流动相：5mm的醋酸铵溶液a和甲醇b；

25、流速：0.2ml/min；

26、柱温：40℃；

27、进样体积：4μl；

28、洗脱条件为：2％b，1.5min；2-85％b，3min；85-100％b，10min；100-2％b，10.1min；2％b，12min；

29、所述质谱条件为：

30、采用q exactive四极杆-轨道场质谱仪(qe)；

31、离子源：电喷雾电离源；

32、正、负离子模式分别扫描，扫描范围选择m/z 100-1500；

33、esi源的设置如下：

34、喷雾电压为3.5kv；

35、鞘气流速为35psi；

36、辅助气流速为10l/min；

37、离子传输管温度为320℃；

38、离子导入射频电平为60；

39、辅助气加热器温度为350℃；

40、ms/ms二级扫描为数据依赖性扫描。

41、步骤s4中，所述校正按照下列步骤进行：将下机数据(.raw)文件导入cd3.1搜库软件中进行处理，对每个代谢物进行保留时间、质荷比的筛选；具体操作进行如下：设置保留时间偏差0.2min和质量偏差5ppm对不同样品进行峰对齐，使鉴定更准确。

42、步骤s4中，所述根际代谢物的鉴定和相对定量结果按照下列步骤获得：设置质量偏差5ppm、信号强度偏差30％、信噪比3、最小信号强度、加和离子进行峰提取，同时对峰面积进行定量，再整合目标离子，然后通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测，并与mzcloud(https://www.mzcloud.org/)、mzvault和masslist数据库进行比对，用仅加入提取液的空白样本去除背景离子，将原始定量结果依据公式进行标准化处理，得到相对峰面积；并将所述质量控制样本溶液中相对峰面积的cv大于30％的化合物删除，最后得到根际代谢物的鉴定和相对定量结果。

43、其中，所述标准化处理的公式如下：

44、相对峰面积＝样本原始定量值/(样本代谢物定量值总和/质量控制样本代谢物定量值总和)

45、步骤s4中，根据牧草的根际代谢物的色谱峰相对面积判断根际代谢物的相对含量结果；色谱峰相对面积≥1.00×109的根际代谢物被认定为相对含量较高的根际代谢物。

46、步骤s4中，所述鉴定的结果如下：

47、所述紫花苜蓿中的根际代谢物的类型包括：脂质及类脂分子、有机酸及其衍生物、有机杂环化合物、苯类化合物、苯丙素和聚酮化合物、有机氧化合物、核苷、核苷酸及其类似物、有机氮化合物、生物碱及其衍生物、有机硫化合物。

48、所述白三叶中的根际代谢物的类型包括：脂质及类脂分子、有机酸及其衍生物、有机杂环化合物、苯类化合物、苯丙素和聚酮化合物、有机氧化合物、核苷、核苷酸及其类似物、有机氮化合物、生物碱及其衍生物、木脂素、新木脂素及相关化合物、有机卤化合物、混合金属/非金属化合物。

49、所述鸭茅中的根际代谢物的类型包括：脂质及类脂分子、有机酸及其衍生物、有机杂环化合物、苯类化合物、苯丙素和聚酮化合物、有机氧化合物、核苷、核苷酸及其类似物、有机氮化合物、生物碱及其衍生物、木脂素、新木脂素及相关化合物、碳氢化合物衍生物。

50、所述多年生黑麦草中的根际代谢物的类型包括：脂质及类脂分子、有机酸及其衍生物、有机杂环化合物、苯类化合物、苯丙素和聚酮化合物、有机氧化合物、核苷、核苷酸及其类似物、生物碱及其衍生物、木脂素、新木脂素及相关化合物、有机卤化合物、均质非金属卤化合物。

51、步骤s4中，所述紫花苜蓿的特征代谢物为：dl-水苏碱、烟酸、l-苯基丙氨酸、脯氨酰甘氨酸二肽酶、枯茗醛、泛醇、巨大戟醇、顺丁烯二酸二乙酯、9-羰基-顺,反-共轭亚油酸、棕榈酸、大豆皂甙i、(+/-)12(13)-dihome、芒柄花黄素、黄豆黄素、鸟嘌呤、肌苷、4-(2-((4-甲氧基苯基)氨基)恶唑)苯甲腈、d-(+)-麦芽糖、α,α-海藻糖、d-(-)-果糖、葫芦巴碱、焦棓酸、黄尿烯酸、dl-苹果酸、柠檬酸、醌酸。

52、所述白三叶的特征代谢物为：甜菜碱、l-苯基丙氨酸、缬氨酸、γ-谷酰亮氨酸、鹰嘴豆素a、黄豆苷元、黄豆黄素、芒柄花黄素、壬二酸、磺胺甲恶唑、(+/-)12(13)-dihome、大豆皂甙i、13(s)-hotre、d-(+)-麦芽糖、α-乳糖、胆碱、3-甲氧苯甲醛、腺苷、腺嘌呤、2-氨基-1,3,4-十八烷三醇、2,4-二甲基苯甲醛、丁炔二酸、新蝶呤、氧代戊酸甲酯。

53、所述鸭茅的特征代谢物为：脯氨酸、甜菜碱、l-谷氨酸、γ-谷氨酰亮氨酸、n-乙酰基-l-谷氨酰胺、4-氧代脯氨酸、油酸酰胺、十六酰胺、油酰乙胺、棕榈酸、d-(+)-麦芽糖、α-乳糖、胆碱、硬脂酰胺。

54、所述多年生黑麦草的特征代谢物为：甜菜碱、油酸酰胺、11,12-环氧-(5z,8z,11z)-黄嘌呤酸、(+/-)12(13)-dihome、腺苷、丁苯吗啉、黄尿烯酸、乳糖、α,α-海藻糖、d-棉子糖、n'-p-酰基精胺。

55、步骤s5中，所述多元统计分析为：利用r软件进行主成分分析(pca)和偏最小二乘方-判别分析(pls-da)，对样本类别、相似性和差异性进行分析，表征样本间代谢物组成整体差异；对于单维统计分析，采用学生氏t检验对变量(代谢物)进行p值计算，用于进一步筛选样本间差异性代谢物。

56、所述变量重要性投影指标包括：p值、vip值和fold change值。使用progenesis qi软件计算代谢物成分p值和fold change值，使用opls-da模型计算vip值。

57、所述筛选的标准为：p值<0.05，vip值>1，fold change值>1.5的代谢物成分，为最终确立不同牧草的差异性代谢物。

58、步骤s5中，所述不同牧草间的差异性代谢物包括：dl-水苏碱、l-麦角硫氨酸、焦谷氨酸、8-氨基辛酸、丙氨酸、n-油酰甘氨酸、烟尿酸、n-[1-(氨基羰基)-3-甲基丁基]氨基甲酸叔丁酯、双丙氨膦、谷氨酰胺、脲基琥珀酸、蛋氨酸、l-组氨酸、γ-谷氨酰亮氨酸、4-羟基异亮氨酸、n-乙酰-l-谷氨酰胺、γ-谷氨酰甲硫氨酸、天冬氨酸-苯丙氨酸、(5-l-谷氨酰)-l-氨基酸、d-苯丙氨酸、4-氧代脯氨酸、n-乙酰基-dl-谷氨酸、枯茗醛、9-oxo-ode、棕榈酸甲酯、7α-羟基睾酮、16-十七炔-1,2,4-三醇、二氢茉莉酸甲酯、3-羟基-3-甲基丁酸、9-oxo-10(e),12(e)-十八碳二烯酸、13-hpode、2-(14,15-环氧二十碳三烯酰基)甘油、5α-二氢睾酮、维生素a、11-脱氧前列腺素f1α、15-脱氧-δ12,14-前列腺素j2-2-甘油酯、pg类磷脂-18:1、5-oxoete、(+/-)12(13)-dihome、二氢玫瑰甙、(+/-)9(10)-dihome、2-羟基己酸、松香脂肪酸、羟基十六酸、辛二酸、15-oxoede、n-乙酰-d-半乳糖胺、n-乙酰基-d-乳糖胺、卡诺胺、烟酸核糖核苷、α,α-海藻糖、水苏糖、2'-脱氧鸟苷、腺苷、肌苷、2'-脱氧腺苷、2'-脱氧胞苷、胞苷、尿苷、鸟嘌呤、次黄嘌呤、激动素、胆碱、dl-肉碱、乙酰胆碱、烟酸、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿囊素、葫芦巴碱、毛果芸香碱、桔皮素、3-甲氧基肉桂酸、大麦芽碱、新蝶呤、奎宁酸。

59、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

60、(1)本发明首次将非靶向代谢组学技术应用于牧草根际土壤中分泌物成分的鉴定，对其代谢物成分种类和相对含量差异进行了研究。

61、(2)本发明采用非靶向代谢组学技术系统、全面地分析了不同牧草根际土壤中的分泌物成分，鉴定出了许多之前研究未报道的物质，极大地丰富了对其根际分泌物的认识。

62、(3)本发明所采用的方法为牧草根际分泌物的进一步开发和利用提供了参考依据，并对其他物种的根际分泌物成分研究提供了新的思路。