DL-乳酸的手性拆分方法及其在人体汗液中DL-乳酸检测方法中的应用

本发明涉及乳酸检测，具体是dl-乳酸的手性拆分方法及其在人体汗液中dl-乳酸检测方法中的应用。

背景技术：

1、乳酸是具有手性碳原子的2-羟基羧酸，因结构中具有一个手性碳原子，在体内以d-乳酸(d-la)和l-乳酸(l-la)两种对映体形式存在。乳酸可以被认为是一种潜在的抗氧化剂，通过清除超氧离子(o2-·)和羟基自由基(·oh)，乳酸可能限制脂质过氧化的起始步骤，从而保护细胞免受氧化损伤。除此之外，dl-乳酸的生成和代谢与人体内多种疾病相关联，尤其是d-la，有研究表明，在糖尿病动物和患者血清当中的d-乳酸浓度显著升高(p<0.0001)。masahiro numako等人发现糖尿病患者唾液中d-乳酸的比例显著增加，唾液中d/l-la比值的增加似乎取决于糖尿病的严重程度。

2、乳酸作为一种重要的功能性成分而被广泛研究。虽然乳酸检测的方法众多，但是传统的方法灵敏度差，在实验过程中的干扰也很常见，降低了其应用水平。生物传感器成本低廉且十分便捷，但是它无法实现乳酸的手性分离。乳酸属于二元羧酸，由于羧酸具有低ph值和高极性，并且许多羧酸缺乏发色基团，因此，在对乳酸进行分析时，柱前衍生化对于提高羧酸检测的灵敏度和选择性是必要的。现有的羧基官能团化合物手性衍生化试剂主要用于荧光(fl)和质谱(ms)的检测。手性胺作为羧基官能团化合物的手性衍生化试剂，具有能与羧基反应的氨基，并且具有靠近反应性氨基官能团的手性中心，羧酸通常在活化试剂如二环己基碳二亚胺(dcc)的存在下被手性伯胺标记。缩合反应通常在温和条件如室温下进行。例如(r)-(+)-4-(3-氨基吡咯烷-1-基)-7-(n，n-二甲氨基磺酰基)-2，1，3-苯并恶二唑(dbd-apy)、4-硝基-7-(3-氨基吡咯烷-1-基)-2，1，3-苯并恶二唑(nbd-apy)、(s)-(+)-1-(2-吡咯烷基甲基)吡咯烷(pmp)、(3r)(+)-3-(三氟乙酰胺基)吡咯烷(tfap)和(r)-(-)-1-氨基茚(ai)]在活化试剂2，2-二吡啶二硫(dpds)和三苯基膦(tpp)的存在下，室温反应90min，与代表性手性羧酸非甾体抗炎药(nsaids)生成相应的酰胺基非对映体，通过hplc-esi-ms/ms进行手性分离。(s)-n-吡咯烷-2-羧酸n-(吡啶-2-基)酰胺(pcp2)、(s)-n-吡咯烷-2-羧酸n-(吡啶-3-基)酰胺(pcp3)和(s)-n-吡咯烷-2-羧酸n-(吡啶-4-基)酰胺(pcp4)结构中具有脯氨酰吡啶部分，这让这些试剂具有高度亲质子特性，而手性吡咯烷结构对对映体羧酸的手性识别起主要作用，反应在室温下进行60min，与羧酸标记后形成酰胺非对映体，随后可以在c18色谱柱上实现分离。三嗪类手性标记试剂(s)-1-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-胺(dmt-3-(s)-apy)[4,10]和(s)-4，6-二甲基-n-(吡咯烷-3-基)-1，3，5-三嗪二胺(dmt-1(s)-apy)在结构中具有手性识别部分、高效反应部分和高度敏感部分，在水溶液中性介质中稳定，并且在储存和标记反应期间不发生外消旋化，与羧酸反应产生相应的酰胺衍生物，实现手性羧酸对映体的分离。

3、与紫外(uv)和fl检测相比，lc-ms/ms和手性衍生化试剂的结合可显示出更高的灵敏度和选择性，更适合于痕量手性羧酸的检测，但是目前现有的可以用于手性羧酸对映体分离的手性衍生化试剂非常有限，因此，开发一种具有良好的手性拆分效能的高灵敏度质谱探针试剂是至关重要的。

4、目前糖尿病的诊断和筛查主要采用血液和尿液的检测。血液作为生物样本，具有应用范围广、准确等优点，但采集血液是伴有刺痛感，具有感染的风险，并且需要专业人员操作，具有侵袭性，患者依从性差；尿液采集次数有限且对患者产生较大的生理负担；唾液虽然是非侵袭性的，但是由于口腔中含有许多的微生物和细菌，这可能会对实验结果产生影响。

5、汗液中也含有乳酸，相比血液、尿液或唾液的采集，汗液采集方便快捷，不具有侵袭性，若能通过汗液中乳酸的检测建立与糖尿病之间的关联性，将为糖尿病的诊断和筛查提供新的方法。但是目前，还未有从人体汗液中检测dl-la的方法。

技术实现思路

1、为解决现有技术的问题，本发明提供了一种汗液中dl-乳酸的手性拆分检测方法，并基于此方法提供了人体汗液干纸片检测试剂盒。

2、为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明提供了一种dl-乳酸手性拆分方法，所述方法包括以下步骤：

4、(1)dl-乳酸样品与otpa衍生化反应；

5、(2)衍生化生成物进uhplc-ms/ms系统，uhplc-ms/ms系统条件为：csh c18(100×2.1mm，1.7μm)色谱柱；流动相a为0.1％的乙酸水溶液，流动相b为0.1％的乙酸甲醇溶液，梯度为等度18％。

6、上述技术方案中，进一步地，柱温40℃，流速0.35ml/min，进样量：1μl。

7、上述技术方案中，进一步地，衍生化反应为1-100mm otpa(n-[1-oxo-5-(triphenyl phosphonium)pentyl]-(s)-3-aminopyrrolidine)、50-150mm edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、50-150mm hobt(1-羟基苯并三唑)、dl-乳酸样品均匀混合，避光条件下，30-60℃恒温反应60-120min；优选地，50mm otpa 50μl、100mm edc 50μl、100mm hobt 50μl、dl-乳酸样品50μl均匀混合，避光条件下，40℃恒温反应90min。

8、本发明提供了前述方法在dl-乳酸含量检测中的应用。

9、上述技术方案中，进一步地，dl-乳酸含量检测的方法包括：

10、(1)权利要求1～3任一项dl-乳酸手性拆分方法，将d-la和l-la的峰完全分离，得到d-la和l-la的峰面积；

11、(2)绘制dl-乳酸标准曲线，横坐标分别为d-la、l-la标准品溶液浓度，纵坐标为d-la和l-la的峰面积；

12、(3)步骤(1)得到的峰面积代入dl-乳酸标准曲线，得到d-la、l-la浓度。

13、本发明还提供了一种人体汗液中dl-乳酸检测方法，所述方法包括以下步骤：

14、(1)采集汗液样品；

15、(2)按照权利要求5所述dl-乳酸含量检测的方法得到汗液中d-la、l-la浓度；

16、所述汗液样品的采集方法为：滤纸片置于人体皮肤上，固定滤纸片确保滤纸片处于密闭状态，静息状态下取样；优选地，滤纸片置于人体手肘皮肤上。

17、上述技术方案中，进一步地，滤纸片样品浸没于体积比1:1的meoh-acn溶液中超声，反复提取合并提取液，离心取上清液，干燥浓缩以体积比1:1的meoh-h2o复溶。

18、本发明提供了一种人体汗液干纸片dl-乳酸检测试剂盒，包括取样管、采样滤纸片、创口贴、说明书、信封；优选地，所述采样滤纸片为直径5mm的圆形滤纸片；所述说明书中记载权利要求6或7的检测方法。

19、上述技术方案中，进一步地，所述试剂盒的使用方法包括：按照权利要求6的方法采集汗液样品，将样品置于取样管中，完成取样，取样管密封于信封中，邮寄给检测机构按照权利要求6或7的检测方法进行dl-乳酸含量测定。

20、本发明提供了前述试剂盒在糖尿病早期预警中应用。

21、与现有技术相比，本发明的有益效果：

22、本发明提供了一种dl-乳酸手性拆分方法，通过dl-乳酸和otpa衍生化，实现了dl-乳酸中d-la和l-la的分离，从而进行d-la和l-la的含量测定。基于本发明的手性拆分及检测方法，本发明提出了检测人体汗液中dl-乳酸含量的方法，应用此方法开发了可简便地检测dl-乳酸的汗液干纸片法试剂盒。

23、本发明的试剂盒相比血液和尿液的采集，更方便、快捷、使用者易于接受，可以足不出户地完成汗液采集，只需微量的汗液即可，节约时间和金钱成本，具有低侵袭性，采集方便的特点，且汗液易于保存、样品前处理简单。

24、通过汗液中乳酸峰面积的d/l比值和l/d比值以及乳酸含量d/l比值和l/d比值的分析发现，糖尿病患者汗液中的d/l-la比值显著高于健康志愿者汗液中的d/l-la比值，有望作为糖尿病疾病早期筛查的新指标，也为糖尿病的手性代谢组学发展和新生物标志物的发现提供了基础数据。