生物反应器酶电极在线检测的自动定标系统及方法与流程

本发明涉及生化分析，特别是涉及到一种生物反应器酶电极在线检测的自动定标系统及方法。

背景技术：

1、工业生物过程一般是在生物反应器中进行，如微生物发酵罐、动植物细胞培养器等。要实现对生物反应过程的优化控制，首先要解决在线检测问题，特别是培养液成分、细胞代谢产物等关键参数(葡萄糖、乳酸等)在线检测技术已成为生物工业普遍关注的问题。

2、酶电极是常用生物传感器的一种类型，一般由固定化酶和电化学电极组成，其特点是分析速度快、测定成本低、样品用量少，样品不需要脱色、过滤、分离等复杂预处理就可测定，适合工业样品大批量、多批次连续检测。

3、流动注射分析是一种基于微管道系统的连续流动分析技术，利用蠕动泵进行不同管径的泵管压缩，在一个密闭、连续的流动载流中完成化学反应与信号检测，特点是流路简单、操作方便、检测速度快、样品用量少等。

4、流动注射与酶电极联用的全自动或在线检测分析仪在食品、发酵、环境等领域得到广泛应用。目前，全自动或在线检测的流动注射分析仪主要采用蠕动泵和机械手臂对样品盘中的多个样品管进行连续取样、稀释、进样和测定。但在工业环境下(如微生物发酵车间)，由于温度、湿度、灰尘、振动等因素的变化或积累会导致机械手臂运行不稳定，影响在线检测的稳定性和准确性。

5、生物反应器(发酵液)组分浓度变化范围很大(0-10.0g％)，而酶电极线性响应浓度范围窄(0-0.10g％)，因此，样品需要稀释后测定，另外，酶电极中的固定化酶活性随着使用时间的延长逐步降低，也需要进行标定。常规机械加工的逆流型液体容器(稀释池、反应池)难以精确定量溶液体积。

6、在申请号：cn202023053891.7的中国专利申请中，涉及到一种双指标酶电极检测装置。本实用新型提供的双指标酶电极检测装置包括反应池、底物酶电极、产物酶电极、缓冲液瓶、标准液瓶和样品液瓶，所述反应池包括通过管道串联的第一反应池和第二反应池；所述第一反应池内设置底物酶电极，第二反应池内设置产物酶电极；所述缓冲液瓶、标准液瓶和样品液瓶通过管道汇总后，再分别与第一反应池和第二反应池通过管道连接。所述双指标酶电极检测装置可实现低浓度和高浓度物质的同时检测且不需要在仪器外进行额外的稀释，提高了检测的精确度。

7、在申请号：cn202011493669.0的中国专利申请中，涉及到一种双指标酶电极检测装置和实现生物反应器底物和产物的在线测试方法。本发明提供的双指标酶电极检测装置包括反应池、底物酶电极、产物酶电极、缓冲液瓶、标准液瓶和样品液瓶，所述反应池包括通过管道串联的第一反应池和第二反应池；所述第一反应池内设置底物酶电极，第二反应池内设置产物酶电极；所述缓冲液瓶、标准液瓶和样品液瓶通过管道汇总后，再分别与第一反应池和第二反应池通过管道连接。所述双指标酶电极检测装置可实现低浓度和高浓度物质的同时检测且不需要在仪器外进行额外的稀释，提高了检测的精确度。

8、在申请号：cn201810491581.1的中国专利申请中，涉及到一种用于发酵液检测的直接生物电极分析装置与分析方法，包括：反应池、生物电极、缓冲液试剂盒以及排空泵。反应一段时间后生物电极接触到生物敏感电极之后，会产生直接电极转移，形成微弱的生物电化学反应电流信号，当进入反应池中的待测底物浓度高的时候，形成的反应电流也高，并且在一点的浓度范围之内，成线性比例关系。由于反应池中采用的工作腔为容量大的反应腔体，稀释了发酵液样品浓度，提供了改系统的抗干扰能力，同时增加了质控、定标、清洗等测空环节，直接生物电极采用高精度工业级微弱信号采集系统，可以了采集测试系统的电磁兼容性能。

9、以上现有技术均与本发明有较大区别，未能解决我们想要解决的技术问题，为此我们发明了一种新的生物反应器酶电极在线检测的自动定标系统及方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种适用于工业现场生物反应器样品组分在线检测的生物反应器酶电极在线检测的自动定标系统及方法。

2、本发明的目的可通过如下技术措施来实现：生物反应器酶电极在线检测的自动定标系统，该生物反应器酶电极在线检测的自动定标系统包括反应池、精密注射器、稀释池、储液管道、第一蠕动泵、第二蠕动泵、第一标准样品瓶、第二标准样品瓶、缓冲液瓶、发酵罐和液体流向转换的第一多通道切换阀、第二多通道切换阀，该第一标准样瓶中装有第一标准液，该第二标准样瓶中装有第二标准液，该发酵罐中装有样品液，该第一多通道切换阀分别连接于该第一标准样品瓶、该第二标准样品瓶、该发酵罐，该第一蠕动泵的一端连接于该第一多通道切换阀，另一端连接于该第二多通道切换阀，该缓冲液瓶中装有缓冲液，并连接于该第二蠕动泵的一端，该第二蠕动泵的另一端连接于该精密注射器，该精密注射器连接于驱动电机进行驱动，并连接于该第二多通道切换阀，该稀释池中装有稀释液，其进液端连接于该第二多通道切换阀，出液端连接于该第一多通道切换阀，该反应池的进液端连接于该第二多通道切换阀，该储液管道的一端连接于该第二多通道切换阀。

3、本发明的目的还可通过如下技术措施来实现：

4、该生物反应器酶电极在线检测的自动定标系统还包括废液池，该废液池分别连接于该储液管道的另一端、该反应池上部的逆流口以及该稀释池上部的逆流口。

5、该生物反应器酶电极在线检测的自动定标系统在运行时，首先，将该缓冲液瓶中的缓冲液充满该反应池和该稀释池；其次，在该反应池进行酶电极定标；再次，在该稀释池进行定标；最后，在该反应池进行样品测定。

6、在需要将缓冲液充满该反应池时，该第二蠕动泵启动，该缓冲液瓶中的缓冲液通过该第二蠕动泵进入该精密注射器，再经由该精密注射器、该第二多通道转换阀进入该反应池，至该反应池充满、溢出，溢出的缓冲液经该反应池上部的逆流口进入该废液瓶，该反应池充满缓冲液后，该第二蠕动泵停止运行；

7、在需要将缓冲液充满该稀释池时，该第二蠕动泵启动，该缓冲液瓶中的缓冲液通过该第二蠕动泵进入该精密注射器，再经由该精密注射器、该第二多通道转换阀进入该稀释池，至该稀释池充满、溢出，溢出的缓冲液经该稀释池上部的逆流口进入该废液瓶，该稀释池充满缓冲液后，该第二蠕动泵停止运行。

8、在该反应池进行酶电极定标时，首先，该第一蠕动泵启动，第二标准液瓶中的第二标准液通过该第一多通道切换阀、该第二多通道切换阀进入到该储液管道，该储液管道充满第二标准液时，该第一蠕动泵停止运行；其次，该精密注射器驱动电机启动，该储液管道中的第二标准液通过该第二多通道切换阀，进入到该取样环中，吸取一定量的第二标准液；再次，该驱动电机启动，将吸取的一定量的第二标准液推出到该第二多通道切换阀后停止，该第二蠕动泵启动，一定量的第二标准液从该第二多通道切换阀注入该反应池中，该第二蠕动泵停止运行，记录该反应池中待酶电极响应过程信号，将酶电极峰值响应信号值定标为x1；待酶电极响应峰值稳定采样后，该第二蠕动泵再次启动，该缓冲液瓶中的缓冲液通过该第二蠕动泵进入该精密注射器，再经由该精密注射器、该第二多通道转换阀进入该反应池，进行该反应池的清洗，溢出的缓冲液经该反应池上部的逆流口进入该废液瓶，该反应池清洗完毕后，该第二蠕动泵停止运行。

9、在该稀释池进行定标时，首先，该第一蠕动泵启动，第一标准液瓶中的第一标准液通过该第一多通道切换阀、该第二多通道切换阀进入到该储液管道，该储液管道充满第一标准液时，该第一蠕动泵停止运行；其次，该精密注射器驱动电机启动，该储液管道中的第一标准液通过该第二多通道切换阀，进入到该取样环中，吸取一定量的第一标准液；再次，该驱动电机启动，将吸取的一定量的第一标准液推出到该第二多通道切换阀后停止，该第二蠕动泵启动，一定量的第一标准液从该第二多通道切换阀注入该稀释池中；然后，该第一蠕动泵启动，该稀释池中稀释后的第一标准液通过该第一多通道切换阀、该第一蠕动泵、该第二多通道切换阀进入到该储液管道中；随后，该精密注射器驱动电机启动，该储液管道中的稀释后的第一标准液通过该第二多通道切换阀，进入到该取样环中，吸取一定量的稀释后的第一标准液；再次，该驱动电机启动，将吸取的一定量的稀释后的第一标准液推出到该第二多通道切换阀后停止，该第二蠕动泵启动，一定量的稀释后的第一标准液从该第二多通道切换阀注入该反应池中，该第二蠕动泵停止运行，记录待酶电极响应过程信号；在该反应池内产生的电信号的峰值为稀释后第一标准液的测定值x2；电信号采集完成后，记录和计算稀释池的稀释倍数y，该第二蠕动泵再次启动，该缓冲液瓶中的缓冲液通过该第二蠕动泵进入该精密注射器，再经由该精密注射器、该第二多通道转换阀进入该反应池，进行该反应池的清洗，溢出的缓冲液经该反应池上部的逆流口进入该废液瓶，该反应池清洗完毕后，该第二蠕动泵停止运行；然后，该第二蠕动泵再次启动，该缓冲液瓶中的缓冲液通过该第二蠕动泵进入该精密注射器，再经由该精密注射器、该第二多通道转换阀进入该稀释池，进行该稀释池的清洗。

10、该稀释池的稀释倍数:

11、y＝n1 x1n2 x2

12、n1:第一标准液标准物(葡萄糖)浓度；

13、n2:第二标准液标准物(葡萄糖)浓度；

14、x1：第二标准液的定标值；

15、x2：稀释后的第一标准液的测定值。

16、在该反应池中进行样品测定时，首先，该第一蠕动泵启动，该发酵罐中的样品液通过该第一多通道切换阀、该第二多通道切换阀进入到该储液管道，该储液管道充满样品液时，该第一蠕动泵停止运行；其次，该精密注射器驱动电机启动，该储液管道中的样品液通过该第二多通道切换阀，进入到该取样环中，吸取一定量的样品液；再次，该驱动电机启动，将取样环吸取的一定量的样品液推出到该第二多通道切换阀后停止，该第二蠕动泵启动，一定量的样品液从该第二多通道切换阀注入该稀释池中；然后，该第一蠕动泵启动，该稀释池中稀释后的样品液通过该第一多通道切换阀、该第一蠕动泵、该第二多通道切换阀进入到该储液管道中，该储液管道中充满后，该第一蠕动泵停止；随后，该精密注射器驱动电机启动，该储液管道中的稀释后的样品液通过该第二多通道切换阀，进入到该取样环中，吸取一定量的稀释后的样品液；再次，该驱动电机启动，将取样环中吸取的一定量的稀释后的样品液推出到该第二多通道切换阀后停止，该第二蠕动泵启动，一定量的稀释后的样品液从该第二多通道切换阀注入该反应池中，该第二蠕动泵停止运行，待酶电极响应峰值x0稳定采样后，计算和记录样品液中样品含量，该第二蠕动泵再次启动，该缓冲液瓶中的缓冲液通过该第二蠕动泵进入该精密注射器，再经由该精密注射器、该第二多通道转换阀进入该反应池，进行该反应池的清洗，溢出的缓冲液经该反应池上部的逆流口进入该废液瓶，该反应池清洗完毕后，该第二蠕动泵停止运行。

17、计算和记录样品液中样品含量的公式为：

18、样品含量(％)＝酶电极响应值(x0)×稀释倍数(y)。

19、本发明的目的也可通过如下技术措施来实现：生物反应器酶电极在线检测的自动定标方法，该生物反应器酶电极在线检测的自动定标方法采用了生物反应器酶电极在线检测的自动定标系统，包括：

20、步骤1，将缓冲液瓶中的缓冲液充满反应池和稀释池；

21、步骤2，在反应池进行酶电极定标；

22、步骤3，在稀释池进行定标；

23、步骤4，在反应池进行样品测定。

24、本发明的目的还可通过如下技术措施来实现：

25、在步骤1，在将缓冲液充满反应池时，第二蠕动泵启动，缓冲液瓶中的缓冲液通过第二蠕动泵进入精密注射器，再经由精密注射器、第二多通道转换阀进入反应池，至反应池充满、溢出，溢出的缓冲液经反应池上部的逆流口进入废液瓶，反应池充满缓冲液后，第二蠕动泵停止运行。

26、在步骤1，在将缓冲液充满稀释池时，第二蠕动泵启动，缓冲液瓶中的缓冲液通过第二蠕动泵进入精密注射器，再经由精密注射器、第二多通道转换阀进入稀释池，至稀释池充满、溢出，溢出的缓冲液经稀释池上部的逆流口进入废液瓶，稀释池充满缓冲液后，第二蠕动泵停止运行。

27、步骤2包括：

28、步骤21，第一蠕动泵启动，第二标准液瓶中的第二标准液通过第一多通道切换阀、第二多通道切换阀进入到储液管道，储液管道充满第二标准液时，第一蠕动泵停止运行；

29、步骤22，驱动电机启动，储液管道中的第二标准液通过第二多通道切换阀，进入到取样环中，吸取一定量的第二标准液；

30、步骤23，驱动电机启动，将取样环中吸取的一定量的第二标准液推出到第二多通道切换阀后停止；第二蠕动泵启动，一定量的第二标准液从第二多通道切换阀注入反应池中，第二蠕动泵停止运行，记录反应池中待酶电极响应过程信号，将酶电极峰值响应信号值定标为x1。待酶电极响应峰值稳定采样后，第二蠕动泵再次启动，缓冲液瓶中的缓冲液通过第二蠕动泵进入精密注射器，再经由精密注射器、第二多通道转换阀进入反应池，进行反应池的清洗，溢出的缓冲液经反应池上部的逆流口进入废液瓶，反应池清洗完毕后，第二蠕动泵停止运行。

31、步骤3包括：

32、步骤31，第一蠕动泵启动，第一标准液瓶中的第一标准液通过第一多通道切换阀、第二多通道切换阀进入到储液管道，储液管道充满第一标准液时，第一蠕动泵停止运行；

33、步骤32，驱动电机启动，储液管道中的第一标准液通过第二多通道切换阀，进入到第二多通道切换阀取样环中，吸取一定量的第一标准液；

34、步骤33，驱动电机启动，将取样环中吸取的一定量的第一标准液推出到第二多通道切换阀后停止，第二蠕动泵启动，一定量的第一标准液从第二多通道切换阀注入稀释池中；

35、步骤34，第一蠕动泵启动，稀释池中稀释后的第一标准液通过第一多通道切换阀、第一蠕动泵、第二多通道切换阀进入到储液管道中；

36、步骤35，驱动电机启动，储液管道中的稀释后的第一标准液通过第二多通道切换阀，进入到取样环中，吸取一定量的稀释后的第一标准液；

37、步骤36，驱动电机启动，将取样环中吸取的一定量的稀释后的第一标准液推出到第二多通道切换阀后停止。第二蠕动泵启动，一定量的稀释后的第一标准液从第二多通道切换阀注入反应池中，第二蠕动泵停止运行，记录待酶电极响应过程信号；在反应池内产生的电信号的峰值为稀释后第一标准液的测定值x2；电信号采集完成后，记录和计算稀释池的稀释倍数y；第二蠕动泵再次启动，缓冲液瓶中的缓冲液通过该二蠕动泵进入精密注射器，再经由精密注射器、第二多通道转换阀进入反应池，进行反应池的清洗，溢出的缓冲液经反应池上部的逆流口进入废液瓶，反应池清洗完毕后，第二蠕动泵停止运行；然后，第二蠕动泵再次启动，缓冲液瓶中的缓冲液通过第二蠕动泵进入精密注射器，再经由精密注射器、第二多通道转换阀进入稀释池，进行稀释池的清洗。

38、在步骤36中，稀释池的稀释倍数:

39、y＝n1 x1/n2 x2

40、n1:第一标准液(标准物)浓度；

41、n2:第二标准液(标准物)浓度；

42、x1：第二标准液的定标值；

43、x2：稀释后的第一标准液的测定值。

44、步骤4包括：

45、步骤41，第一蠕动泵启动，发酵罐中的样品液通过第一多通道切换阀、第二多通道切换阀进入到储液管道，储液管道充满样品液时，第一蠕动泵停止运行；

46、步骤42，驱动电机启动，储液管道中的样品液通过第二多通道切换阀，进入该第二多通道切换阀取样环中，吸取一定量的样品液；

47、步骤43，驱动电机启动，将取样环中吸取的一定量的样品液推出到第二多通道切换阀后停止，第二蠕动泵启动，一定量的样品液从第二多通道切换阀注入稀释池中；

48、步骤44，第一蠕动泵启动，稀释池中稀释后的样品液通过第一多通道切换阀、第一蠕动泵、第二多通道切换阀进入到储液管道中，储液管道中充满后，第一蠕动泵停止；

49、步骤45，驱动电机启动，储液管道中的稀释后的样品液通过第二多通道切换阀，进入到第二多通道切换阀取样环中，吸取一定量的稀释后的样品液；

50、步骤46，驱动电机启动，将取样环中吸取的一定量的稀释后的样品液推出到第二多通道切换阀后停止，第二蠕动泵启动，一定量的稀释后的样品液从第二多通道切换阀注入反应池中，第二蠕动泵停止运行，待酶电极响应峰值x0稳定采样后，计算和记录样品液中样品含量；第二蠕动泵再次启动，缓冲液瓶中的缓冲液通过第二蠕动泵进入精密注射器，再经由精密注射器、第二多通道转换阀进入反应池，进行反应池的清洗，溢出的缓冲液经反应池上部的逆流口进入废液瓶，反应池清洗完毕后，第二蠕动泵停止运行。

51、在步骤46，计算和记录样品液中样品含量的公式为：

52、样品含量(％)＝酶电极响应值(x0)×稀释倍数(y)。

53、本发明中的生物反应器酶电极在线检测的自动定标系统及方法，设计了具有相对恒定溶液体积的逆流池作为酶电极反应池和样品稀释池，应用于微管道系统的酶电极连续流动分析。在实际运行中，采用已知浓度的标准液分别对酶电极反应活性和样品稀释倍数进行测定，并通过样品稀释倍数和酶电极活性的定标，不配置机械手臂就能获取试液传递的精准信息，使分析系统的器件加工和组装简单可行，又具有检测系统的稳定性和准确性，适用于工业现场生物反应器(发酵罐等)样品组分(葡萄糖、乳酸等)在线检测。