一种缺血修饰白蛋白校准品及其应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及一种缺血修饰白蛋白校准品及其应用。

背景技术：

1、缺血修饰白蛋白(ischemia modified albumin，ima)是人血清白蛋白(humanserum albumin，hsa)在心肌缺血的情况下转化而来的心肌缺血标志物之一。人血清白蛋白的氨基末端序列为人类所特有，是钴、铜和镍等过渡金属离子的结合位点。正常白蛋白与过渡金属的结合能力较强。在心肌缺血时，血流减少导致组织供氧不足并且ph值降低，形成超氧自由基和过氧化氢。在铜或铁等金属的存在下，过氧化氢会发生芬顿反应(fentonreaction)，形成羟基自由基。羟基自由基具有高活性，能够改变白蛋白分子氨基末端的氨基酸。氨基末端改变后的白蛋白不能与金属离子结合。这种在缺血过程中产生的不能与金属离子结合的白蛋白被称为缺血修饰白蛋白。

2、心血管疾病是全球一大死亡原因，每年夺走约1790万人的生命。急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，acs)是临床上常见的心血管疾病，其是指冠状动脉内不稳定的粥样斑块破裂或糜烂引起血栓形成所导致的心脏急性缺血综合征。心肌缺血的表现是多种多样的，如胸痛、上腹不适、呼吸困难、恶心呕吐等。然而，这些症状可能是微妙且不容易识别。由于症状表现多样，发病急且死亡率高，因此对急性心肌梗死患者的早期诊断至关重要。

3、近年来，缺血标志物有了快速的发展。传统的心肌缺血标志物，如肌红蛋白(myo)、肌钙蛋白(ctn)和肌酸激酶同工酶mb(ck-mb)的特异性和敏感性较好，但它们在心肌细胞损伤发生约3-6小时后才显示出明显的上升，这时患者已受到了不可逆的病理损伤。缺血修饰白蛋白是美国食品药品监督管理局(fda)认可的第一个检测心肌缺血的生化标志物，其对acs患者心肌缺血检出灵敏度是心电图(ecg)的2倍、肌钙蛋白(ctn)的4倍。与传统心肌缺血标志物不同，ima在心肌缺血发作5-10分钟后血中浓度即可升高，于2-6小时达峰值，12-24小时基本恢复正常。因此ima可用于评价早期可逆性心肌缺血并对acs的早期诊断、指导治疗、改善患者的预后和减少死亡率等方面具有重要的临床意义。

4、目前，ima的检测方法主要为白蛋白钴结合试验(albumin cobalt binding test，简称acb法)间接法。利用ima结合过渡金属co2+能力减弱的性质进行定量测定。血清样本中白蛋白以活性形式存在，加入氯化钴溶液后，co2+即可与白蛋白结合，而溶液中剩余的游离co2+与二硫苏糖醇反应生成红褐色产物。由于ima含量与颜色程度呈正比，在505nm处检测吸光度，可间接对ima进行定量测定，通过特殊配制的校准品定标后，并直接以ima形式报告结果。

5、acb间接法测定ima的结果受人血清白蛋白和缺血修饰白蛋白的稳定性影响较大。传统方法利用血清基质和缺血修饰白蛋白作为制备校准品的原料，但经证明，人血清白蛋白和缺血修饰白蛋白在血清基质中都非常不稳定，在2-8℃环境存储条件下，放置一个月，测值降低20％左右，因此也给存储和冷链运输方面带来很大的压力。公开号为cn109557322a的中国专利公开了一种利用edta螯合剂来配制校准品的方法，相较于传统方法的血清校准品更高效稳定且简易，同时降低了成本。但这种利用edta配制的校准品与已上市的ima试剂定标时会存在基质效应，严重影响测试结果。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种缺血修饰白蛋白校准品及其应用，对现有技术中的校准品的配方进行改进，获得的校准品的稳定性较好，能够长期贮存，并且不存在edta配制的校准品与已上市的ima试剂定标时的基质效应，检测结果更为准确，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

2、本发明提供一种缺血修饰白蛋白校准品，所述校准品的原料包括缓冲液、螯合剂、表面活性剂、稳定剂和防腐剂，所述螯合剂为二乙烯三胺五乙酸五钠、羟乙基乙二胺三乙酸三钠盐、酒石酸钠和柠檬酸钙中的任意一种和多种。

3、进一步的，所述表面活性剂为壬基酚聚氧乙烯醚、emulgen 1118s-70、聚苯乙烯交联二乙烯苯、聚氧乙烯月桂醚、triton x-405、吐温80、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的任意一种或多种。

4、进一步的，所述稳定剂为亚麻酸乙酯、油酸甲酯、硫酸钠、氯化钙、甲基-β-环糊精、2-羟丙基-α-环糊精、牛血清白蛋白、二甲基亚砜、甘油中的任意一种或多种。

5、进一步的，所述缓冲液为哌嗪-n,n'-二(2-乙磺酸)缓冲液、哌嗪-n,n'-双(2-羟基丙烷磺酸)缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液、n,n-二羟乙基甘氨酸缓冲液中的任意一种，所述缓冲液的ph值为7.0-9.0。

6、进一步的，所述防腐剂为叠氮化钠、对羟基苯甲酸钠、proclin 200、proclin300、proclin 950、山梨酸钾中的任意一种或多种。

7、进一步的，所述校准品的原料包括1-500mm缓冲液、0.05-50mm螯合剂、0.01-2％表面活性剂、0.1％-10％稳定剂和0.05％-1％防腐剂。

8、进一步的，所述螯合剂为二乙烯三胺五乙酸五钠。

9、进一步的，所述校准品为水平试剂1、水平试剂2和水平试剂3，所述水平试剂1、水平试剂2和水平试剂3具有不同的螯合剂的浓度。

10、本发明还提供一种检测缺血修饰白蛋白的方法，所述方法采用螯合剂作为校准品的主要原料，所述螯合剂为为二乙烯三胺五乙酸五钠、羟乙基乙二胺三乙酸三钠盐、酒石酸钠和柠檬酸钙中的任意一种和多种。

11、本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的标准品；

12、优选的，所述试剂盒还包括试剂r1和试剂r2；

13、其中，所述试剂r1的组分包括氯化钴；

14、所述试剂r2的组分包括二硫苏糖醇。

15、本发明还提供一种如上述的校准品和/或上述的试剂盒用于检测缺血修饰白蛋白的应用。

16、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

17、本发明提供一种缺血修饰白蛋白校准品，其中的螯合剂为二乙烯三胺五乙酸五钠、羟乙基乙二胺三乙酸三钠盐、酒石酸钠和柠檬酸钙中的任意一种和多种，并添加了表面活性剂和稳定剂，得到的校准品一方面相较于传统血清基质校准品的稳定性更好，其能够在长途冷链运输中稳定储存，另一方面相较于edta螯合剂校准品，其不存在基质效应，避免了基质效应对测试结果的影响，使用该校准品检测缺血修饰白蛋白，其检测灵敏度高、特异性强、成本低，可实现对缺血修饰白蛋白(ima)的准确检测。

技术特征：

1.一种缺血修饰白蛋白校准品，其特征在于，所述校准品的原料包括缓冲液、螯合剂、表面活性剂、稳定剂和防腐剂，所述螯合剂为二乙烯三胺五乙酸五钠、羟乙基乙二胺三乙酸三钠盐、酒石酸钠和柠檬酸钙中的任意一种和多种。

2.如权利要求1所述的缺血修饰白蛋白校准品，其特征在于，所述表面活性剂为壬基酚聚氧乙烯醚、emulgen 1118s-70、聚苯乙烯交联二乙烯苯、聚氧乙烯月桂醚、triton x-405、吐温80、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的任意一种或多种。

3.如权利要求1所述的缺血修饰白蛋白校准品，其特征在于，所述稳定剂为亚麻酸乙酯、油酸甲酯、硫酸钠、氯化钙、甲基-β-环糊精、2-羟丙基-α-环糊精、牛血清白蛋白、二甲基亚砜、甘油中的任意一种或多种。

4.如权利要求1所述的缺血修饰白蛋白校准品，其特征在于，所述缓冲液为哌嗪-n,n'-二(2-乙磺酸)缓冲液、哌嗪-n,n'-双(2-羟基丙烷磺酸)缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液、n,n-二羟乙基甘氨酸缓冲液中的任意一种，所述缓冲液的ph值为7.0-9.0；

5.如权利要求1所述的缺血修饰白蛋白校准品，其特征在于，所述校准品的原料包括1-500mm缓冲液、0.05-50mm螯合剂、0.01-2％表面活性剂、0.1％-10％稳定剂和0.05％-1％防腐剂。

6.如权利要求1所述的缺血修饰白蛋白校准品，其特征在于，所述螯合剂为二乙烯三胺五乙酸五钠。

7.如权利要求1所述的缺血修饰白蛋白校准品，其特征在于，所述校准品为水平试剂1、水平试剂2和水平试剂3，所述水平试剂1、水平试剂2和水平试剂3具有不同的螯合剂的浓度。

8.一种检测缺血修饰白蛋白的方法，其特征在于，所述方法采用螯合剂作为校准品的主要原料，所述螯合剂为为二乙烯三胺五乙酸五钠、羟乙基乙二胺三乙酸三钠盐、酒石酸钠和柠檬酸钙中的任意一种和多种。

9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-7中任一项所述的标准品；

10.一种如权利要求1-7中任一项所述的校准品和/或权利要求9所述的试剂盒用于检测缺血修饰白蛋白的应用。

技术总结
本发明公开一种所述校准品的原料包括缓冲液、螯合剂、表面活性剂、稳定剂和防腐剂，所述螯合剂为二乙烯三胺五乙酸五钠、羟乙基乙二胺三乙酸三钠盐、酒石酸钠和柠檬酸钙中的任意一种和多种。本发明的校准品的稳定性较好，能够长期贮存，并且不存在EDTA配制的校准品与已上市的IMA试剂定标时的基质效应，检测结果更为准确，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

技术研发人员：胡承禹,吴传侠,陈小茹,吴向东
受保护的技术使用者：深圳上泰生物工程有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15