一种用于LNP-mRNA破乳效率评价的方法与流程

本发明涉及医药工程领域，特别是mrna制品领域，具体涉及一种用于lnp-mrna破乳效率评价的方法。

背景技术：

1、mrna药物是通过将编码抗原蛋白的mrna接种到人体，利用人体细胞内的遗传物质进行表达合成抗原蛋白，通过抗原蛋白诱导和激活机体的免疫系统产生免疫反应，从而达到预防和治疗疾病的目的。由于其具有较低的感染和突变风险，能够同时诱导产生体液免疫和细胞免疫，免疫效能好，研发和生产周期短，容易实现量产等特点，目前被广泛用于传染性疾病、肿瘤及罕见病药物的研发。在疫情后，脂质纳米颗粒(lnps)初期广泛用于小分子和核酸药物的递送，近年来因其作为covid-19mrna疫苗递送平台的巨大成功而备受关注。各类mrna制品纷纷开始采用lnps技术作为递送系统，可以有效避免rna降解，提高mrna进入细胞的效率，进而提高制品的功效。lnps通常由甘油磷脂、阳离子脂质、固醇脂质和包覆寡核苷酸的聚乙二醇化脂质组成(聚乙二醇化脂质属于亲水部分)。lnps中使用的许多相同的结构组件也是其他脂质载体给药系统技术(如脂质体、固体脂质纳米颗粒)的组件。其中包封率是评价lnp-mrna非常关键的指标。表示lnp-mrna包裹工艺过程中有多少mrna被包裹在纳米颗粒内部。在体外实验或体内治疗时，精确的剂量是非常重要的，因此我们必须要知道纳米脂质颗粒内部究竟有多少mrna被有效地包裹进去

2、如果lnp-mrna生物学活性很低，原因可能是多方面的，但是如果可以知道lnps内部包封的mrna含量是足够的，就可以初步排除lnp-mrna是在包封过程中出现了问题，通过对lnp-mrna包封率的检测，可以摸索lnps的配方和包封参数，也能够监测lnp-mrna稳定性是否随时间而发生改变。还可以对包封后的mrna进行精确定量。

3、检测lnp-mrna的包封率需要对lnps进行裂解破乳处理，对破乳前后的mrna进行定量测定，进而计算得到包封率结果。前处理涉及一步很关键的裂解破乳处理，现有技术公开的方法，大多是采用表面活性剂或有机溶剂进行破乳。kinsey c等于2021年在electrophoresis上发表了一篇使用液相色谱与cad联用进行lnps脂质成分测定的文献中，使用乙醇：甲酰胺(85:15％v/v)溶液进行lnp制品的破乳处理，进而实现对脂质组成分的测定工作。中检院虫媒室于2022年在国际生物制品学杂质上发表题为“不同条件对ribogreen法检测mrna疫苗中mrna含量的影响”的文章，文章使用不同比例的triton x100作为裂解液，对lnp-mrna制品进行破乳处理，继而通过ribogreen检测方法，对mrna进行定量，确定0.5％trition x100裂解5分钟为最佳的lnp-mrna破乳条件。2023年4月美国药典发布了最新的mrna疫苗质量分析方法中，新引进了lnp-mrna破乳后提取mrna进行断裂体和聚集体分析的需求，采用60mm乙酸铵的异丙醇进行lnp-mrna的破乳，进而对mrna部分进行回收，测定其断裂体及聚集体的情况。

4、使用有机溶剂和表面活性剂进行破乳处理的方法已经被广泛应用于以lnps作为递送系统的制品的质量分析中，但现有的技术及文献并没有系统的研究过所选用的破乳裂解方式是否能够对lnp-mrna实现完全破坏，释放出内部包封的制品组分用于质量分析，即破乳效率的评价，若破乳不完全，所检测到的内部包封制品组分的相关结果并不能真实反馈lnps内部所包封制品的实际情况，影响研究人员对于制品质量的判定，故破乳效率就成为质量分析结果准确与否的一个关键的考量。因此，本领域亟需提供可以直观评价破乳效率的方法，对所选用的破乳裂解条件进行评价，评价在该破乳裂解条件下，是否对lnps实现完全破乳，进而保证质量分析结果的准确。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种便利、直观的破乳效率评价方式，该方法通过使用粒度分析仪，对空lnp样品在不同百分比triton x--100(tx-100)处理不同时间后的粒径进行分析，通过粒径的变化趋势，对破乳效率进行评价。当空lnp样品经过破乳处理后的样品会无限接近于同样比例的破乳剂triton x--100的粒径分布。

2、本发明提供了一种基于粒径测试，进行lnps制品破乳效率评价的方法。测定破乳后的lnp样品的粒径，通过观察粒径的变化趋势，判定lnp样品是否破乳完全。

3、优选地，所述破乳中使用的破乳剂为triton x--100。

4、优选地，所述破乳的具体过程为：

5、s1：将lnp样品在室温下分别利用破乳剂破乳0min、30min、60min，或在4℃下破乳过夜；

6、s2：利用粒径仪对破乳后的lnp样品进行粒径测定；

7、s3：使用s2不同大小分子数量进行拟合的粒径分布图说明破乳效率。

8、优选地，s1所述lnp样品为空lnp样品或lnp-mrna样品。

9、优选地，所述lnp样品可换选为脂质体作为递送系统的样品。

10、优选地，所述lnp样品可换选为纳米脂质载体作为递送系统的样品。

11、优选地，s2所用的粒径仪为马尔文粒度仪。

12、本发明取得如下有益技术效果：

13、本发明所公开的基于粒径分析进行脂质纳米颗粒作为递送系统的制品破乳效率评价的方法，利用该方法可以脂质纳米颗粒的破乳效率进行评价，方法简单，成本相对较低，具有很高的实际应用价值，为脂质纳米颗粒作为递送系统的制品，提供较为直观的破乳效率评价方式。

技术特征：

1.一种用于lnp-mrna破乳效率评价的方法，其特征在于，测定破乳后的lnp样品的粒径，通过观察粒径的变化趋势，判定lnp样品是否破乳完全。

2.根据权利要求1所述的用于lnp-mrna破乳效率评价的方法，其特征在于，所述破乳中使用的破乳剂为triton x--100。

3.根据权利要求1所述的用于lnp-mrna破乳效率评价的方法，其特征在于，所述破乳的具体过程为：

4.根据权利要求3所述的用于lnp-mrna破乳效率评价的方法，其特征在于，s1所述lnp样品为空lnp样品或lnp-mrna样品。

5.根据权利要求3所述的用于lnp-mrna破乳效率评价的方法，其特征在于，所述lnp样品可换选为脂质体作为递送系统的样品。

6.根据权利要求3所述的用于lnp-mrna破乳效率评价的方法，其特征在于，所述lnp样品可换选为纳米脂质载体作为递送系统的样品。

7.根据权利要求3所述的用于lnp-mrna破乳效率评价的方法，其特征在于，s2所用的粒径仪为马尔文粒度仪。

技术总结
本发明涉及医药工程领域，特别是mRNA制品领域，具体涉及一种用于LNP‑mRNA破乳效率评价的方法；该方法采用表面活性剂作为破乳裂解溶剂进行LNP制品的破乳处理，使用粒径分析仪，从粒径分析的角度来判定破乳的程度，适用于以脂质纳米颗粒为递送系统的制品。利用该方法可以脂质纳米颗粒的破乳效率进行评价，方法简单，成本相对较低，具有很高的实际应用价值，为脂质纳米颗粒作为递送系统的制品，提供较为直观的破乳效率评价方式。

技术研发人员：连智慧
受保护的技术使用者：耀海生物技术（北京）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/21