一种检测尼帕病毒的引物组、修饰引物组及其应用

本发明属于检验检疫，尤其涉及一种检测尼帕病毒的引物组、修饰引物组及其应用。

背景技术：

1、尼帕病毒(niv)是亨尼帕病毒属的人畜共患病原体，可引起人类脑炎和呼吸道症状，致死率高达75％。niv是单股负链rna病毒，基因组含有18246个核苷酸，编码6种结构蛋白，依次是核蛋白(nucleoprotein，n)、磷蛋白(phosphpprotein，p)、基质蛋白(matrix-protein，m)、融合蛋白(fusionprotein，f)、糖蛋白(glycoprotein，g)和大蛋白(1argeprotein，l)。尼帕病毒入侵宿主细胞是通过ph非依赖性的膜融合机制实现的，这其中蛋白f和g是必需的。p蛋白mrna编码709个氨基酸，比其他的副黏病毒的p蛋白多100个氨基酸，分子量约为78ku，是p基因中编码的最大蛋白，p蛋白有两个主要的功能：一是保护病毒基因组rna免受破坏；二是参与病毒rna的转录和复制，它是niv主要的免疫显性抗原，也是病毒基因组中具有最多分叉的蛋白。g蛋白mrna编码602个氨基酸，分子量约为67ku，为病毒表面糖蛋白，能刺激机体产生中和性抗体，是主要的保护性抗原。

2、niv患者的治疗和niv疾病控制都需要具有高灵敏度和特异性的诊断测试，以便能够早期发现人类niv感染。传统上，niv的准确诊断依赖于血清学、分子或病毒学分析，核酸扩增试验(naats)，如逆转录酶pcr(rt-pcr)，是检测活动性病毒感染的首选方法。然而，niv感染往往发生在卫生和实验室基础设施较差的地区，这些基础设施较差的地区都不具备naats所需的实验室基础设施。elisa等血清学检测方法具有温度依赖性，假阳性率高，只能提供niv感染的间接证据。仅针对niv病原n基因检测，也会由于样品选择不当、无法区分转录子和病毒基因组等原因造成假性检测结果。因此发展一种检测速度快、使用方便、经济有效、结果准确以及能在资源匮乏的区域兼容的检测方法很有必要。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够即时检测尼帕病毒的引物组，能够与微流控胶体金检测技术相结合使用，具有方便、简捷、灵敏度适中、特异性好、准确度高的优势。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种检测尼帕病毒的引物组，所述引物组为组1引物和组2引物中的至少一组；组1引物中引物对的核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示；组2引物中引物对的核苷酸序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示。

4、本发明还提供了一种检测尼帕病毒的修饰引物组，采用荧光基团和半抗原标记上述引物组。

5、优选的，所述荧光基团包括6-fam，所述半抗原包括地高辛。

6、本发明还提供了上述引物组或上述修饰引物组在制备尼帕病毒检测产品中的应用。

7、本发明还提供了一种尼帕病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。

8、本发明还提供了一种尼帕病毒微流控pcr-胶体金检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的修饰引物组、微流控芯片和胶体金检测试纸条；所述胶体金检测试纸条的上样板处固定有抗荧光基团抗体，质控线处有抗荧光基团抗体的抗体，检测线设计为半抗原结合线。

9、本发明还提供了一种非诊断目的的尼帕病毒微流控pcr-胶体金检测方法，包括如下步骤：将含有待测样本rna和修饰引物组的反应体系添加到微流控芯片的加样孔中，利用微流控pcr仪反应，反应结束后，采用胶体金检测试纸条进行检测，检测线和质控线均显色为阳性，仅质控线显色为阴性，若质控线未显色，则视为结果无效，需要重测。

10、优选的，当所述修饰引物组为组1引物的修饰引物组时，所述微流控pcr仪的反应程序为：55℃ 5min；95℃ 150s，1个循环；95℃ 5s、60℃ 20s，35个循环。

11、优选的，当所述修饰引物组为组2引物的修饰引物组时，所述微流控pcr仪的反应程序为：55℃ 5min；95℃ 150s，1个循环；95℃ 5s、55℃ 20s，35个循环。

12、优选的，所述反应体系以20μl计，包括酶混合液1μl、buffer混合液14μl和模板5μl。

13、本发明的有益效果：

14、本发明避免选择高转录活性的尼帕病毒n基因作为靶点，同时增加低转录活性的尼帕病毒p和g双基因作为靶点，保证了病毒分子诊断的可靠性。本发明对niv的g蛋白和p蛋白进行引物设计，所设计的引物具有准确度高、灵敏度适中、特异性好的优势，而且能够与微流控、胶体金方法结合使用。利用微流控技术，在芯片中完成目的片段扩增，最后通过胶体金技术，实现可视化结果，具有方便、简捷、灵敏度高、重复性好的特点。本发明反应在微流控芯片反应腔内从rna到扩增结束一步完成，省去了逆转录到扩增的两步反应，减少了开盖污染，避免出现假阳性的结果。本发明检测下限不低于1048copies/μl。

15、本发明提供的试剂盒能即时检测，在采样现场即刻进行分析，减少了对样品复杂处理程序，快速得到检验结果，对快速控制生物危害、防止感染传播以及诊断偏远地区的传染病具有重大意义。本发明采用微流控胶体金检测技术，可在现场完成核酸提取到pcr扩增再到检测结果的整个过程，极大地压缩了诊断的时间。除此之外，微流控加上胶体金技术的诊断结果准确率极高，并且基本实现了自动检测的流程，还能做到压缩检测成本提高效率的作用。

16、本发明利用了微流控技术，将检测等过程集成到了几平方厘米的芯片上，实现了微型化、自动化、集成化和便携化。具有样品消耗少、检测速度快、操作简便、多功能集成、体积小和便于携带等优点，极大地拓展了现场即时诊断的应用空间。

技术特征：

1.一种检测尼帕病毒的引物组，其特征在于，所述引物组为组1引物和组2引物中的至少一组；组1引物中引物对的核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示；组2引物中引物对的核苷酸序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示。

2.一种检测尼帕病毒的修饰引物组，其特征在于，采用荧光基团和半抗原标记权利要求1所述引物组。

3.根据权利要求2所述的修饰引物组，其特征在于，所述荧光基团包括6-fam，所述半抗原包括地高辛。

4.权利要求1所述引物组或权利要求2-3任意一项所述修饰引物组在制备尼帕病毒检测产品中的应用。

5.一种尼帕病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物组。

6.一种尼帕病毒微流控pcr-胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2或3所述的修饰引物组、微流控芯片和胶体金检测试纸条；所述胶体金检测试纸条的上样板处固定有抗荧光基团抗体，质控线处有抗荧光基团抗体的抗体，检测线设计为半抗原结合线。

7.一种非诊断目的的尼帕病毒微流控pcr-胶体金检测方法，其特征在于，包括如下步骤：将含有待测样本rna和修饰引物组的反应体系添加到微流控芯片的加样孔中，利用微流控pcr仪反应，反应结束后，采用胶体金检测试纸条进行检测，检测线和质控线均显色为阳性，仅质控线显色为阴性，若质控线未显色，则视为结果无效，需要重测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当所述修饰引物组为组1引物的修饰引物组时，所述微流控pcr仪的反应程序为：55℃ 5min；95℃ 150s，1个循环；95℃ 5s、60℃20s，35个循环。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当所述修饰引物组为组2引物的修饰引物组时，所述微流控pcr仪的反应程序为：55℃ 5min；95℃ 150s，1个循环；95℃ 5s、55℃20s，35个循环。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述反应体系以20μl计，包括酶混合液1μl、buffer混合液14μl和模板5μl。

技术总结
本发明提供了一种检测尼帕病毒的引物组、修饰引物组及其应用，属于检验检疫技术领域。本发明对尼帕病毒的G蛋白基因和P蛋白基因进行引物设计，所设计的引物具有灵敏度高、特异性好的优势，而且能够与微流控、胶体金方法结合使用。利用微流控技术，在芯片中完成目的片段扩增，最后通过胶体金技术，实现可视化结果，具有方便、简捷、灵敏度高、重复性好的特点。本发明反应在微流控芯片反应腔内从RNA到扩增结束一步完成，省去了逆转录到扩增的两步反应，减少了开盖污染，避免出现假阳性的结果。本发明检测下限不高于1048copies/μL。

技术研发人员：王茂鹏,陈文聪,邓安琦,唐秀兰,叶丹妮,邓玲聪,艾雪言,陈嘉豪,刘宇航,叶冠吟
受保护的技术使用者：温州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/21