一种硝酸硫康唑起始原料咪唑乙醇有关物质的检测方法与流程

本发明涉及药物分析，特别是涉及一种硝酸硫康唑起始原料咪唑乙醇有关物质的检测方法。

背景技术：

1、硝酸硫康唑是一种咪唑衍生物，具有广谱抗真菌作用，可抑制包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌和犬小孢子菌等常见致病皮肤真菌的生长，也可以抑制造成花斑癣的微生物、糠秕马拉色菌以及某些革兰阳性菌。其结构式如下：

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3、立体结构：硝酸硫康唑有一个手性中心，结构式中用*标注，产品为硝酸硫康唑消旋体。

4、作为合成硝酸硫康唑的起始原料咪唑乙醇，其结构式如下所示：

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6、咪唑乙醇中可能存在并需要进行研究的有关物质包括：杂质ii-1、ii-2、ii-3、ii-4、ii-5、ii-6、ii-7、ii-8、ii-9和ⅱ-3，共10个杂质。具体信息如下表所示：

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9、咪唑乙醇为合成硝酸硫康唑关键步骤的起始原料，为了保证药物的安全性，有必要对其有关物质进行研究。其中ii-4、ii-5为主成分(咪唑乙醇)的二氯代苯环位置异构体，杂质ii-6、ii-7及ii-8互为单甲基取代咪唑环位置异构体，上述位置异构体杂质因极性差异较小，难以采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱进行分离。咪唑(杂质ii-2)为制备咪唑乙醇最后一步反应用到的关键物料，是咪唑乙醇中存在的主要工艺杂质，应对其进行重点控制。

10、通过相关文献及专利调研发现：咪唑(杂质ii-2)及其结构类似物的检测方法包括紫外分光光度法、气相色谱法、流动相中加入离子对试剂的高效液相色谱法、柱前衍生化法及lc-ms/gc-ms法等。刘娜等发表的《克霉唑阴道片中微量咪唑测定方法》，以己烷磺酸钠作为离子对试剂，甲醇-磷酸二氢钾/磷酸缓冲液为流动相进行梯度洗脱；程利侠等采用柱前衍生-高效液相色谱法测定烟用添加剂中微量咪唑的含量，以丹磺酰氯为衍生试剂，柱前衍生，经乙酸乙酯萃取、浓缩、乙腈定容后，经c18色谱柱分离，用乙腈-水为流动相梯度洗脱，荧光检测器测定；专利文献《一种测定碱性反应液中咪唑含量的高效液相色谱分析方法与流程》，以十二烷磺酸钠作为离子对试剂，乙腈-磷酸二氢钾/磷酸缓冲液为流动相进行梯度洗脱。咪唑的结构简单，其结构和极性与咪唑乙醇及其他杂质差异较大，可以考虑采用上述相关报道中的检测方法单独控制咪唑含量，但难以同步测定咪唑(杂质ii-2)、异构体杂质(杂质ii-4、ii-5、ii-6、ii-7、ii-8)和其他极性较小的杂质，且一旦使用相关报道中的离子对试剂(己烷磺酸钠、十二烷磺酸钠等)后，离子对将永久残留于色谱柱中，造成色谱柱重现性和使用寿命下降，使得色谱柱不可继续用于分离检测其他无需加入离子对试剂到流动相中的化合物，导致检验成本大幅增加。柱前衍生化法、lc-ms/gc-ms法亦存在操作过程相对复杂、系统适用性及专属性差等缺陷。现有文献中均未有较为满意的方法公开。

技术实现思路

1、为了解决现有检测方法的上述问题，本发明提供一种硝酸硫康唑起始原料咪唑乙醇有关物质的检测方法。本发明方法能够有效分离并同步测定杂质ii-1、ii-2、ii-3、ii-4、ii-5、ii-6、ii-7、ii-8、ii-9和ⅱ-3，共10个杂质；方法简单，不影响色谱柱的重现性和使用寿命，成本低；同时具备专属性、系统适用性、灵敏度、线性、精密度、准确度及耐用性良好等优势。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种硝酸硫康唑起始原料咪唑乙醇有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：全氟苯基硅烷键合硅胶色谱柱，以活性炭为填料的鬼峰捕集柱；以六氟磷酸钾水溶液为流动相a，乙腈为流动相b。

4、根据本发明优选的，流动相a六氟磷酸钾水溶液的浓度为20～30mmol/l。优选的，流动相a六氟磷酸钾水溶液的浓度为25mmol/l；六氟磷酸钾水溶液的配制方法为：将六氟磷酸钾溶于水中，用磷酸调节ph值至3.7，即得。

5、咪唑乙醇及其有关物质多为含咪唑结构的路易斯碱性化合物，当流动相中缓冲盐选用六氟磷酸钾，并调整ph至小于待测物的pka-2，使含咪唑环的杂质转换成离子态时，六氟磷酸根在反向色谱中可发挥一定的弱离子对效能，从而增强极性较大的咪唑(杂质ii-2)在反向色谱中的保留，且六氟磷酸钾不会永久残留于色谱柱中，较己烷磺酸钠等离子对试剂有显著优势。本发明在流动相a缓冲盐种类的筛选试验中发现，当选用六氟磷酸钾溶液浓度为20～30mmol/l，并选用全氟苯基硅烷键合硅胶色谱柱时，可以在一个分析方法下，同步检测咪唑、苯环位置异构体、咪唑环位置异构体和其他杂质。

6、根据本发明优选的，流动相采用如下梯度程序洗脱：

7、在0～2分钟内，流动相a和流动相b的体积比保持80:20不变；在2～5分钟内，流动相a和流动相b的体积比由80:20线性渐变至65:35；在5～15分钟内，流动相a和流动相b的体积比保持65:35不变；在15～22分钟内，流动相a和流动相b的体积比由65:35线性渐变至20:80；在22～30分钟内，流动相a和流动相b的体积比保持20:80不变；在30～30.1分钟内，流动相a和流动相b的体积比由20:80线性渐变至80:20；在30.1～40分钟内，流动相a和流动相b的体积比保持80:20不变。

8、根据本发明优选的，色谱柱选择：ace excel 3 c18-pfp，4.6mm×250mm，3μm；捕集柱：welch ghost-buster column，4.6mm×50mm。

9、根据本发明优选的，色谱条件包括：采用紫外检测器，检测波长为220nm；柱温选自40～50℃，优选为45℃；流动相流速选自0.8～1.2m/min，优选为1.0ml/min；进样体积：10μl。

10、根据本发明优选的，采用乙腈的水溶液作为稀释剂配制供试品溶液、对照溶液，其中，乙腈和水的体积比为1:1；精密量取对照溶液、供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。

11、根据本发明优选的，按照加校正因子的自身对照品法计算咪唑乙醇中各杂质的含量。

12、根据本发明，一种优选的技术方案，所述检测方法包括：

13、(1)色谱条件为：

14、仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器；色谱柱：ace excel 3 c18-pfp，4.6mm×250mm，3μm；捕集柱：welch ghost-buster column，4.6mm×50mm；流动相a：25mmol/l、ph为3.7的六氟磷酸钾水溶液；流动相b：乙腈；流动相流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；柱温：45℃；进样体积：10μl；

15、梯度洗脱程序：

16、 时间(分钟) 流动相a体积占比(％) 流动相b体积占比(％) 0 80 20 2 80 20 5 65 35 15 65 35 22 20 80 30 20 80 30.1 80 20 40 80 20

17、(2)溶液配制：

18、稀释剂：乙腈的水溶液，其中，乙腈和水的体积比为1:1。

19、供试品溶液：精密称定咪唑乙醇，用稀释剂超声溶解并稀释制成每1ml溶剂中含咪唑乙醇0.5mg的溶液，摇匀。

20、对照溶液：精密量取供试品溶液，用稀释剂稀释制成每1ml溶剂中含咪唑乙醇0.5μg的溶液，摇匀。

21、(3)测定法：

22、精密量取稀释剂、对照溶液及供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按照加校正因子的自身对照品法计算咪唑乙醇中各杂质的含量。

23、本发明的技术特点及有益效果如下：

24、1、本发明通过对多种色谱柱型号的系统筛选，最终确定了选用ace excel 3 c18-pfp，4.6mm×250mm，3μm色谱柱，对咪唑乙醇中的位置异构体杂质分离效能最佳。本方法检测波长为220nm，因接近末端吸收，存在基线波动情况，本方法通过使用鬼峰捕集柱基本消除了基线波动对检测的干扰。

25、2、本发明未选用文献报道的强离子对试剂(己烷磺酸钠、十二烷磺酸钠等)，而是选用了具备弱离子对效能的六氟磷酸钾，并摸索出了最佳的缓冲盐浓度、ph范围，从而实现了采用一种检测方法同步准确测定咪唑乙醇中的咪唑和其他杂质含量的目的，且本方法因未使用离子对试剂，不影响色谱柱的重现性和使用寿命，降低了检验成本，提高了方法的重现性和适用性。本发明使用的具备弱离子对效能的缓冲盐六氟磷酸钾酸性流动相体系和ace excel 3 c18-pfp色谱柱尚未在测定咪唑乙醇中的杂质咪唑和异构体杂质含量的相关文献或专利报道中出现，为同步测定化学药物、起始原料及中间体中的咪唑和位置异构体类杂质提供了新思路。

26、3、本发明方法通过对色谱柱、流动相、洗脱程序等色谱条件的筛选，实现了采用一种分析方法对咪唑乙醇中可能存在的多个苯环/咪唑环位置异构体和在反向色谱中几乎无保留的杂质咪唑的同步测定。本发明方法作为一个整体，各步骤、条件共同作用使得本发明能够有效分离并同步测定杂质ii-1、ii-2、ii-3、ii-4、ii-5、ii-6、ii-7、ii-8、ii-9和ⅱ-3，共10个杂质；方法简单，不影响色谱柱的重现性和使用寿命，成本低；同时具备专属性、系统适用性、灵敏度、线性、精密度、准确度及耐用性良好等优势。