同时检测尿液中柠檬酸、草酸和胱氨酸的检测方法及试剂盒与流程

本发明涉及分析检测，尤其涉及同时检测尿液中柠檬酸、草酸和胱氨酸的检测方法及试剂盒。

背景技术：

1、草酸钙是最常见的结石，主要是由于体内钙和草酸水平之间的不平衡和/或缺乏足够的结晶抑制剂而形成的。尿草酸过多或高草酸尿症的原因可根据病因和临床表现的严重程度分为原发性（罕见）和继发性（常见）高草酸尿症。草酸（ox）的检测方法主要有液相色谱法，液相色谱质谱法，显色试纸法，离子色谱法等。

2、柠檬酸盐是钙盐结晶的强效抑制剂。柠檬酸钾治疗对原发性或继发性低柠檬酸尿症和酸化障碍患者有效。低柠檬酸尿症被认为是肾结石形成的原因。柠檬酸（ca）的检测方法主要有液相色谱法，液相色谱质谱法等。

3、胱氨酸尿症是一种常染色体隐性或不完全性遗传病。这种疾病会破坏胱氨酸和其他二元氨基酸在肾近端小管中的转运，导致肾结石反复形成。肾近端小管细胞对胱氨酸的重吸收缺陷，会导致胱氨酸过度排进尿液中，促使远端肾小管中的胱氨酸沉淀。而且胱氨酸在尿液中的溶解度较低，促使患者有较高的形成胱氨酸结石的倾向。胱氨酸（cys）的检测方法主要有液相色谱质谱联用法，气相色谱分析法等。

4、现有技术中已经有公开同时检测柠檬酸、草酸和胱氨酸的方法，例如cn115389684a公开了一种同时检测24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸的方法，但是其衍生化过程中需采用苯甲醇、三甲基氯硅烷、四甲基氟化铵和乙腈多种试剂，且衍生化反应温度高达80℃，衍生化反应时间需75min。又如cn116381104a公开了一种有机酸的检测方法及其应用，其前处理中未进行衍生化处理，色谱分离后各物质分离度和峰型不佳，受环境ph影响较大，无法适用于制备试剂盒检测。

5、因此，如何提供一种样本前处理方法简单快速、衍生化试剂少、检测准确度高的适用于制备试剂盒的检测方法，成为本领域亟待解决的技术难题。

技术实现思路

1、首先，本发明提供了一种同时检测尿液中柠檬酸、草酸和胱氨酸的检测方法，包括：

2、将待测样本与酸化剂混合，离心后获得第一上清液；

3、将所述第一上清液与衍生剂混合后进行衍生；所述衍生剂为正丁醇和三甲基氯硅烷的混合液；

4、将衍生后的混合液与水混合终止所述衍生，离心后获得第二上清液，以用于液相色谱检测。

5、本发明通过对衍生化试剂的大量筛选发现，选择正丁醇和三甲基氯硅烷搭配作为衍生化试剂时，尿液样本中的柠檬酸、草酸和胱氨酸同时具有较好的衍生化效果，使得后续色谱检测过程中三者具有较好的峰型和分离度，同时该衍生化反应所使用的试剂种类少，衍生化温度低，本发明的检测方法更加适用于制备试剂盒进行检测。

6、优选地，所述待测样本为24h尿液。

7、优选地，所述衍生剂中，正丁醇和三甲基氯硅烷的体积比为（1~10）：1。

8、更优选地，所述衍生剂中，正丁醇和三甲基氯硅烷的体积比为（1.5~2.5）：1。

9、优选地，所述第一上清液与正丁醇的体积比为1：（1~20）。

10、优选地，所述衍生的温度为90℃以下。

11、较优选地，所述衍生的温度为65℃以下。

12、更优选地，所述衍生的温度为62℃以下。

13、优选地，所述酸化剂为盐酸、硫酸、硝酸中的至少一种。

14、选择酸化剂为盐酸时，能够使得尿液样本的酸化效果更好，酸化后的尿液样本与上述衍生化试剂混合后，能够更好地进行衍生化反应。

15、优选地，每1ml待测样本中加入10~100μl酸化剂。

16、优选地，在4000rpm以上离心；更优选为10000rpm以上离心。

17、优选地，将所述第二上清液与样本稀释剂混合，离心后获得第三上清液，采用液相色谱检测所述第三上清液。

18、优选地，所述样本稀释剂与液相色谱流动相的试剂相同。

19、优选地，所述样本稀释剂为甲醇和甲酸铵水溶液的混合液。

20、优选地，将所述第二上清液与样本稀释剂混合，在1000rpm以上震荡，然后在3000rpm以上离心后获得第三上清液，采用液相色谱检测所述第三上清液。

21、优选地，所述液相色谱检测的条件包括：

22、c18色谱柱；

23、流动相a：甲酸铵、甲酸和水的混合液；

24、流动相b：甲酸铵、甲酸和甲醇的混合液；

25、流动相a和流动相b中，甲酸铵的浓度为0.005~0.02mol/l；甲酸占流动相a总体积的0.05%~0.20%；

26、洗脱过程中流动相a和流动相b的体积百分比之和为100%；

27、洗脱条件为：

28、。

29、优选地，所述c18色谱柱为shim-pack velox sp-c18，其规格为2.7μm，2.1×50mm。

30、优选地，所述c18色谱柱为shim-pack velox c18，其规格为2.7μm，2.1×50mm。

31、优选地，流动相的流速为0.1~0.6 ml/min。

32、优选地，所述检测方法还包括在所述液相色谱检测之后，采用质谱进行定量检测（lc-ms检测）。

33、在一些实施方案中，采用质谱进行定量检测时，离子信息如表1所示。

34、表1

35、

36、表中，表示定量离子。

37、在一些实施方案中，所述检测方法还包括：采用校准品和/或质控品与所述待测样本进行相同处理后进行检测。

38、在一些实施方案中，向所述第一上清液中加入内标工作液、正丁醇和三甲基氯硅烷振荡后衍生。

39、进一步，本发明提供了一种实现上述任一实施方案中检测方法的试剂盒，包括：

40、校准品、质控品、内标工作液、衍生剂正丁醇、衍生剂三甲基氯硅烷、酸化剂、用于液相色谱检测的流动相试剂。

41、优选地，所述校准品包括c1~c6，c1中包括5~15μg/ml的草酸、35~45μg/ml的柠檬酸、2~6μg/ml的胱氨酸；c2中包括18~25μg/ml的草酸、75~85μg/ml的柠檬酸、8~14μg/ml的胱氨酸；c3中包括35~45μg/ml的草酸、150~170μg/ml的柠檬酸、15~20μg/ml的胱氨酸；c4中包括70~80μg/ml的草酸、250~350μg/ml的柠檬酸、25~35μg/ml的胱氨酸；c5中包括100~200μg/ml的草酸、500~700μg/ml的柠檬酸、55~65μg/ml的胱氨酸；c6中包括220~280μg/ml的草酸、800~1200μg/ml的柠檬酸、80~120μg/ml的胱氨酸。

42、优选地，所述质控品包括q1~q3，q1中包括25~35μg/ml的草酸、100~150μg/ml的柠檬酸、10~15μg/ml的胱氨酸；q2中包括100~150μg/ml的草酸、450~550μg/ml的柠檬酸、40~60μg/ml的胱氨酸；q3中包括160~180μg/ml的草酸、600~800μg/ml的柠檬酸、65~85μg/ml的胱氨酸。

43、优选地，所述内标工作液中包括80~120μg/ml的草酸内标（ox-is）、30~70μg/ml的柠檬酸内标（ca-is）、30~70μg/ml的胱氨酸内标（cys-is）。

44、优选地，所述酸化剂为1~12 mol/l盐酸溶液。

45、优选地，所述流动相试剂包括：1~10mol/l甲酸铵水溶液、甲酸以及甲醇。

46、本领域公知，知晓待测样本中的草酸，柠檬酸和胱氨酸的含量，也不意味着该结果可以直接指向泌尿结石等相关疾病的诊断结果，因此本发明提供的检测方法是非诊断和治疗目的。

47、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

48、本发明的检测方法适用于制备试剂盒进行检测，该检测方法能同时满足柠檬酸、草酸、胱氨酸的线性、重复性、批间差、准确度等要求，可同时检测柠檬酸、草酸和胱氨酸，具有灵敏度高，重复性好，准确性高，特异性好等特点。