WNV蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法与流程

本发明涉及生物医药，特别涉及一种wnv蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法。

背景技术：

1、 西尼罗病毒(west nile virus，wnv)是一种近年来在全球广泛传播的黄病毒,主要由库蚊进行传播，人感染后可导致西尼罗热。因1937年首次在乌干达西尼罗地区的一位女性发热患者体内发现而被命名为西尼罗病毒，此后在亚洲、欧洲和澳大利亚小规模传播，于1999年在美国爆发并迅速传播到北美其他地区后引起高度关注。人经wnv感染会出现流感样症状，少数患者会进展为严重的神经侵袭性疾病如脑炎、脑膜炎等，严重可导致死亡。

2、 wnv属于黄病毒科黄病毒属，是一种单股正链rna病毒，基因全长约为11 kb，病毒直径在40~60 nm。wnv基因组包含一个开放阅读框，编码一条多聚蛋白，此多聚蛋白被切割成3个结构蛋白：衣壳蛋白(c)，前体膜(prm)、包膜蛋白(e)和7个非结构蛋白：ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b、ns5。其中ns2b是ns3的辅助因子,与ns3蛋白n端丝氨酸蛋白酶域在内质网膜上形成异源二聚体,组成ns2b/ns3蛋白酶，负责切割多聚蛋白的ns2a/ns2b、ns2b/ns3、ns3/ns4a和ns4b/ns5。ns2b/ns3蛋白酶复合物在病毒的复制和组装中起到至关重要的作用，因此wnv的ns2b/ns3蛋白酶是抗病毒药物开发的主要靶点。迄今为止，并没有特异性治疗西尼罗病毒感染的上市药物。因此,研发低毒、高效的抗西尼罗病毒药物具有重要意义。

3、目前有多种wnv的ns2b/ns3蛋白酶抑制剂被研究发现。主要可分为两类，肽类与非肽类。肽类抑制剂相对分子质量较大，稳定性与选择性低。而非肽类抑制剂相对分子质量较小且选择性与稳定性更高，但是活性普遍低于肽类抑制剂。现有的西尼罗病毒抑制剂由于活性问题、安全性低、以及药代动力学性质不佳等不足,尚不能满足治愈西尼罗病毒感染的要求。因此仍需要进行大量药物筛选工作以改善此类问题。大多数高传染性病毒的细胞抗病毒实验需要在bsl-2+或者更高等级的实验室进行，然而这种实验室的资源相当短缺。目前，wnv-ns2b/ns3蛋白酶抑制剂的活性评价方法主要为荧光共振能量转移法。荧光共振能量转移法是目前应用较为广泛的高通量筛选方法，具有快捷、灵敏、可定量和重复性好等优点，但荧光剂易受小分子化合物影响而导致假阳性问题，同时，许多体外活性良好的抑制剂因为其细胞膜通透性或者特异性不好，在细胞内没有活性或活性很弱。因此，开发一种简洁、安全、高通量和可重复性的蛋白酶活性和蛋白酶抑制剂筛选及活性检测平台十分必要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种wnv蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法，无需使用活病毒，安全性好，能够高效、准确、稳定、高通量的进行wnv蛋白酶抑制剂的筛选和抑制效果评价。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种wnv蛋白酶抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：

4、（1）构建共表达改造的gfp和wnv ns2b/ns3蛋白酶的质粒，所述改造的gfp为在野生型gfp上插入wnv ns2b/ns3蛋白酶切割序列而成；

5、（2）筛选：将待转染细胞铺于多孔板中，然后加入共表达改造的gfp和wnv ns2b/ns3蛋白酶的质粒进行转染，对转染后的细胞进行培养，同时向多孔板中添加不同组的待筛选抑制剂，以不添加待筛选抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；若与对照相比荧光强度增加，则表示待筛选抑制剂具有抑制效果，荧光强度增加越多则代表待筛选抑制剂的抑制效果越强。

6、 本发明在绿色荧光蛋白（gfp）中插入wnv的ns2b/ns3蛋白酶相关裂解位点的序列，形成改造后的荧光蛋白报告蛋白系统，在该荧光蛋白报告蛋白质粒上，克隆表达wnvns2b/ns3蛋白酶，可用于筛选蛋白酶抑制剂以及对蛋白酶抑制剂活性的评价，最终形成wnv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。本发明能够避免使用wnv活病毒引发的安全性顾虑，对生物安全等级要求低，bsl-1级实验室即可满足实验要求，是高效、准确、稳定、高通量、可重复的用于wnv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。

7、 wnv ns2b/ns3蛋白酶切割序列在野生型gfp氨基酸序列上的插入位点包括位点b和位点c；

8、位点b为野生型gfp氨基酸序列第117~118位氨基酸，或与野生型gfp氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；

9、位点c为野生型gfp氨基酸序列第159~160位氨基酸，或与野生型gfp氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；

10、所述野生型gfp氨基酸序列见seq id no.1所示。

11、本发明中，位点b为野生型gfp氨基酸序列第117~118位氨基酸，或与野生型gfp氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；对应的氨基酸区域指的是与野生型gfp氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上与野生型gfp氨基酸序列的第117~118位氨基酸相对应的位置。其它类似表述的地方参考本处释义。

12、 发明人研究发现，在上述两个特定位点（位点b和位点c）插入wnv ns2b/ns3蛋白酶切割序列后，改造的gfp荧光蛋白仍然可以检测到激发荧光。

13、 wnv ns2b/ns3蛋白酶切割序列包括cut1、cut2，cut1氨基酸序列为sgkrsqig，cut2氨基酸序列为glkrggak。wnv ns2b/ns3蛋白酶切割序列能准确地被wnv ns2b/ns3蛋白酶识别和切割，切割后则会破坏荧光蛋白发光功能，导致荧光淬灭。

14、一种表达改造的gfp质粒，改造的gfp表达后，仍然可以检测到激发荧光。

15、改造的gfp质粒的制备方法为：

16、将野生型gfp的基因序列通过同源重组方式克隆到表达质粒载体的多克隆位点之间构建表达野生型gfp的质粒；

17、通过同源重组方式，在表达野生型gfp的质粒上的gfp基因序列中插入wnv ns2b/ns3蛋白酶切割序列对应的核苷酸序列，构建表达改造的gfp的质粒。

18、 一种共表达改造的gfp和wnv ns2b/ns3蛋白酶的质粒，所述质粒包括表达wnvns2b/ns3蛋白酶的编码基因序列以及表达改造的gfp的编码基因序列；所述改造的gfp为在野生型gfp上插入wnv ns2b/ns3蛋白酶切割序列而成。改造的gfp荧光蛋白和wnv ns2b/ns3蛋白酶共表达后，wnv ns2b/ns3蛋白酶可以切割改造的gfp荧光蛋白，导致荧光淬灭。若存在有效的蛋白酶抑制剂的情况下，则蛋白酶功能被抑制，无法发挥作用切割wnv ns2b/ns3蛋白酶切割序列，使得荧光蛋白的发光功能得以保留，这便是本发明筛选蛋白酶抑制剂的原理。

19、一种wnv蛋白酶抑制剂的抑制效果评价方法，包括以下步骤：

20、（1）构建共表达改造的gfp和wnv ns2b/ns3蛋白酶的质粒，所述改造的gfp为在野生型gfp上插入wnv ns2b/ns3蛋白酶切割序列而成；

21、（2）评价：将待转染细胞铺于细胞培养皿中，然后加入共表达改造的gfp和wnvns2b/ns3蛋白酶的质粒进行转染，对转染后的细胞进行培养，同时向细胞培养皿中添加抑制剂，以不添加抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；荧光强度正向反映抑制剂的抑制效果，荧光强度越高则代表抑制剂的抑制效果越强。

22、本发明的有益效果是：无需使用活病毒，安全性好，能够高效、准确、稳定、高通量的进行wnv蛋白酶抑制剂的筛选和抑制效果评价。