一种微量白蛋白/肌酐联合检测试剂条及其制备方法和应用与流程

本发明属于免疫检测，涉及一种微量白蛋白/肌酐联合检测试剂条及其制备方法和应用。

背景技术：

1、荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术，该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。对于只具有单一抗原表位的小分子抗原(农兽药、违禁药物等)，待测小分子抗原与荧光标记抗体结合后，由于空间位阻作用难以再与检测线上的包被抗体结合。所以，具有单一抗原表位的小分子待测物多采用竞争免疫层析法检测。

2、白蛋白是一种小蛋白，在血浆中的浓度很高。在正常情况下，只有少量白蛋白排泄到尿液中。尿微量白蛋白浓度持续性升高被称作微量白蛋白尿。在六个月内，如果三次尿样检测中至少有两次的尿微量白蛋白排泄率(aer)在20到200μg/min之间，即可确诊为微量白蛋白尿，意味着肾功能的病变。

3、肌酐是肌肉组织蛋白质肌酸的降解产物。所有的肌酐都会透过肾小球基膜，并且排泄到尿中。由于肌肉的降解是一个连续的过程，肌酐的滤过也具有一个恒定的速率。因此，测定尿中的肌酐可以对尿液排泄的波动进行校正。

4、尿液中微量白蛋白(malb)的含量用尿肌酐(cre)做校正可以消除取样方式和尿量对尿白蛋白排泌量的影响，因此将对白蛋白排泄率提供更准确的评价，可用于肾病的辅助诊断，对预防糖尿病肾病的发生有较大的临床意义。

5、目前，尿微量白蛋白和肌酐的比值(acr)已经成为肾病诊断十分重要的预测指标，并且也用于确定存在罹患糖尿病并发症和高血压的风险。美国糖尿病协会指南建议每年进行一次检验，以便在诊断开始时评估有5年以上糖尿病史的1型糖尿病患者以及所有2型糖尿病患者尿液白蛋白分泌量。

6、目前检测尿液中微量白蛋白和肌酐的检测方法主要有试纸比色法、免疫生化法和放射免疫法等。试纸比色法操作简便，能够迅速看到结果，但结果特异性和灵敏度比较差，更适用于定性检测，进行人群疾病筛查，而不适用于临床诊断，肌酐比色法主要采用的多步酶反应，肌酐通过肌酐氨基水解酶生成肌酸，肌酸通过肌酸脒基水解酶生产肌氨酸，后续通过肌氨酸氧化酶、过氧化物酶以及色原等进行氧化还原显色反应进行比色测试。反应的中间产物有肌酸，而人体正常代谢，尿液中会有大量肌酸产生，这样会导致假性肌酐值偏高，测试结果准确度偏低；免疫生化法灵敏度和特异性都比较好，但一般耗时较长(一般1到2小时)，需要大型仪器，检测过程复杂步骤多，且肌酐是小分子物质，制备得到肌酐多克隆抗体即作为肌酐检测工具酶应用上，因为肌酐和肌酸结构的相似性，免疫法亦存在肌酸干扰。放射免疫法的优点是灵敏、特异、简便易行、用样量少，但缺点是用到放射性物质，存在辐射损伤污染的可能性，且操作仪器较大，步骤繁琐。

7、综上所述，开发高效、快速且准确地检测尿微量白蛋白和肌酐的产品及方法具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种微量白蛋白/肌酐联合检测试剂卡及其制备方法和应用，以期实现高效、快速且准确地检测微量白蛋白和肌酐。

2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种微量白蛋白/肌酐联合检测试剂条，所述试剂条包括底板和在底板上依次搭接的样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫，所述结合垫上包被有标记有标记物的肌酐多克隆抗体、标记有标记物的白蛋白抗体和标记有标记物的吗啡牛血清白蛋白抗体或二硝基苯酚(dnp)单克隆抗体，所述分析膜上设置有第一检测线(t1线)、第二检测线(t2线)和质控线(c线)，所述第一检测线上包被有白蛋白，所述第二检测线上包被有肌酐和钥孔血蓝蛋白偶联物，所述质控线上包被有吗啡牛血清白蛋白或二硝基苯酚小分子物质。

4、本发明中，设计全新的检测试剂条，采用肌酐和钥孔血蓝蛋白偶联物包被检测线，利用肌酐和钥孔血蓝蛋白偶联，可有效提高肌酐与大分子蛋白之间的亲和性，有利于提高检测相关性及、线性范围及灵敏度；同时，钥孔血蓝蛋白与微量白蛋白(malb)的同源性相比牛血清白蛋白(bsa)低，降低检测中产生的干扰；使用吗啡牛血清白蛋白(或dnp小分子物质)和标记有标记物的吗啡牛血清白蛋白抗体(或dnp单克隆抗体)进行独立质控，显著提高检测一致性，整体协同，实现高效、快速且准确地检测微量白蛋白和肌酐。

5、优选地，所述样品垫包被有样品垫处理液，所述样品垫处理液含有三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、pluracare 1307prill(s9)，曲拉通100和肌酸脒基水解酶。

6、优选地，所述二硝基苯酚小分子物质包括二硝基苯酚-牛血清白蛋白偶联物(dnp-bsa)。

7、优选地，所述样品垫处理液中三羟甲基氨基甲烷盐酸盐浓度为100～200mm(例如110mm、120mm、150mm、160mm、180mm或190mm等)，pluracare 1307prill(s9)体积百分比为0.5％～1％(例如0.6％、0.7％、0.8％或0.9％等)，曲拉通100体积百分比为0.5％～1％(例如0.6％、0.7％、0.8％或0.9％等)和肌酸脒基水解酶体积百分比为0.5％～1％(例如0.6％、0.7％、0.8％或0.9％等)。

8、本发明中，采用特定的样品垫处理液处理样品垫，能够有效降低样本中肌酸的影响同时减少样本中其他盐离子等组分对检测干扰，提高检测准确性。

9、优选地，所述标记物选自荧光素、磷光素、荧光微球、磷光微球、胶体金、酶、生物素、磁性微球、发光底物、彩色胶乳或量子点中任意一种或至少两种的组合。

10、优选地，所述样品垫和结合垫的材料各自独立地选自玻璃纤维素膜、聚酯纤维素膜、纤维素滤纸或无纺布；所述分析膜的材料选自硝酸纤维素膜或尼龙膜。

11、优选地，所述肌酐和钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，klh)偶联物中肌酐和钥孔血蓝蛋白通过交联剂连接。

12、优选地，所述交联剂包括戊二醛。

13、本发明中，采用双功能交联剂(如戊二醛等)将钥孔血蓝蛋白与肌酐共价交联，例如以戊二醛为交联剂，先将肌酐与戊二醛分子一段的醛基反应，再加入钥孔血蓝蛋白与戊二醛分子另一端的醛基反应，得到肌酐和钥孔血蓝蛋白偶联物。

14、本发明中，可根据实际需求设置第一检测线(t1线)、第二检测线(t2线)和质控线(c线)的位置关系，例如自样品垫至吸水垫方向，依次等间隔设置t1线、t2线和c线。

15、第二方面，本发明提供一种第一方面所述的微量白蛋白/肌酐联合检测试剂条的制备方法，所述方法包括：

16、在分析膜上包被白蛋白形成第一检测线，包被肌酐和钥孔血蓝蛋白偶联物形成第二检测线，包被吗啡牛血清白蛋白或dnp小分子物质形成质控线；将标记有标记物的肌酐多克隆抗体、标记有标记物的白蛋白抗体和标记有标记物的吗啡牛血清白蛋白抗体或dnp单克隆抗体包被到结合垫上；将样品垫、结合垫和分析膜以及吸水垫组装在底板上，得到所述试剂条。

17、优选地，所述白蛋白的包被浓度为1～2mg/ml，包括但不限于1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.8mg/ml、或1.9mg/ml。

18、优选地，所述肌酐和钥孔血蓝蛋白偶联物的包被浓度为0.5～1mg/ml，包括但不限于0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml或0.9mg/ml。

19、优选地，所述吗啡牛血清白蛋白或dnp小分子物质的包被浓度为0.5～1mg/ml，包括但不限于0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml或0.9mg/ml。

20、优选地，所述白蛋白、肌酐和钥孔血蓝蛋白偶联物以及吗啡牛血清白蛋白或dnp的包被量各自独立地为0.25～4.0μl/cm。

21、优选地，所述标记有标记物的肌酐多克隆抗体、标记有标记物的白蛋白抗体和标记有标记物的吗啡抗体或dnp单克隆抗体的包被浓度各自独立地为0.5～1mg/ml，包括但不限于0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml或0.9mg/ml。

22、上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

23、优选地，所述标记有标记物的肌酐多克隆抗体、标记有标记物的白蛋白抗体和标记有标记物的吗啡抗体或dnp单克隆抗体的喷量各自独立地为5-10μl/cm。

24、本发明中，可采用本领域通用方法对肌酐多克隆抗体、白蛋白抗体和吗啡牛血清白蛋白抗体或dnp单克隆抗体标记标记物，具体标记物可根据试剂需求选择，例如可选择荧光微球。

25、本发明中，可采用本领域通用的包被方法进行包被，例如使用点膜仪喷涂。

26、优选地，所述方法还包括预处理样品垫的步骤，包括将样品垫与样品垫处理液接触并进行干燥处理。

27、优选地，所述样品垫处理液含有三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、pluracare 1307prill(s9)、曲拉通100和肌酸脒基水解酶。

28、优选地，所述样品垫处理液中三羟甲基氨基甲烷盐酸盐浓度为100～200mm，pluracare1307prill(s9)体积百分比为0.5％～1％，曲拉通100体积百分比为0.5％～1％和肌酸脒基水解酶体积百分比为0.5％～1％。

29、第三方面，本发明提供一种微量白蛋白/肌酐联合检测试剂盒，所述试剂盒包括检测卡和样本稀释液，所述检测卡包括卡壳和第一方面所述的微量白蛋白/肌酐联合检测试剂条；所述卡壳包括相互卡接的上卡壳和下卡壳，下卡壳的内表面设置有用于放置试剂条的卡槽，上卡壳对应于试剂条的样品垫处设有加样口、对应于试剂条的分析膜处设有观测口，分析膜上的第一检测线、第二检测线和质控线均暴露于观测口处。

30、本发明中，卡壳不仅能够保护试剂条，避免其受损污染，还起到固定的作用，使得试条不易出现滑动，影响测定。上、下卡壳能够将试剂条固定且压紧，结合垫上的标记抗体和样品稀释液能够同步运行，保证液体流速均匀，从而进一步降低cv系数，提高精密度和准确性，同时操作方便，放平直接加样即可快速测试，对操作人员无硬性技术要求。另外可设计卡壳与检测设备能够配套使用，卡壳插入检测设备相应的通道，自动稳定送样检测，进一步提高检测结果的准确性，蛋白含量测定值更加精确。

31、优选地，所述样本稀释液含有nacl、kcl、na2hpo4·12h2o、kh2po4和proclin300。

32、优选地，所述样本稀释液中nacl质量百分比为4％～8％，kcl质量百分比为0.1％～0.2％，na2hpo4·12h2o质量百分比为2％～4％，kh2po4质量百分比为0.1％～1％，proclin300质量百分比为0.05％～0.1％。

33、本发明中，设计特定组分的样本稀释液，能够有效降低样本中各种盐离子等组分对检测干扰，提高检测准确性。

34、优选地，所述试剂盒还包括定标卡，所述定标卡指用来存放标曲的组件。

35、第四方面，本发明提供一种以非疾病诊断为目的的检测微量白蛋白和/或肌酐的方法，所述方法包括：

36、将待测样品加到第一方面所述的微量白蛋白/肌酐联合检测试剂条的样品垫上，进行荧光检测。

37、优选地，所述方法还包括构建标准曲线的步骤，包括分别利用已知梯度浓度的微量白蛋白(malb)或肌酐为样本，利用所述试剂条进行检测，测定荧光信号强度，利用t1或t2线的荧光信号强度(记为t1或t2)和c线的荧光信号强度的比值为纵坐标，以浓度为纵坐标，即可分别构建微量白蛋白定量标准曲线或肌酐定量标准曲线。

38、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

39、本发明设计全新的微量白蛋白/肌酐联合检测试剂条，设计特定组分对结合垫、检测线和质控线进行包被，整体协同，显著提高线性检测范围、灵敏度和一致性，设计独立质控，设计使用吗啡或者dnp之类小分子物质制备半抗原和抗体组合，可以避免常规使用的动物源二抗与尿液中白蛋白检测的干扰作用，设计特定的样品垫处理液和样本稀释液，能够有效降低尿液样本中肌酸以及其他各种盐离子等组分对检测干扰，提高检测准确性，能够实现一次取样而同时快速、准确地对微量白蛋白和肌酐同时进行定量检测。