一种基于纳米酶信号放大的电化学小分子生物传感器、微流控芯片装置及其制备方法和应用

本发明属于电化学分析检测，具体涉及到一种基于纳米酶信号放大的电化学小分子生物传感器、微流控芯片装置及其制备方法和应用。

背景技术：

1、crispr/cas系统(聚集的规则间隔的短回文重复序列/crispr相关核酸酶)是近年来发展起来的一项新技术，crispr/cas系统在分子诊断、基因组编辑等领域有着广泛的应用，甚至由于其独特的顺式切割和反式切割能力在食品安全和环境领域也得到了广泛的应用。

2、然而，目前大多数基于crispr/cas系统的分析都需要扩增目标或额外引入信号放大策略，例如杂交链式反应、催化发夹型dna自组装反应、熵驱动催化反应等，虽然这些信号放大技术可以提高基于crispr检测方法的灵敏度，但它们所需的反应时间、复杂的引物设计和繁琐的操作程序限制了crispr检测的灵活性和速度。尤其是非核酸靶标的检测，如毒素、蛋白质和病原菌等，需要通过识别转换元件将非核酸信号处理成核酸信号，以便后续检测。

3、因此，为了保证食品安全，如满足快速现场检测的要求，开发无扩增的检测平台来非常必要的。

技术实现思路

1、本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

3、因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种基于纳米酶信号放大的电化学小分子生物传感器。

4、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：所述传感器包括金电极100和修饰在所述金电极100反应端表面的功能层200；

5、其中，所述功能层200为6-巯基乙醇和pd@pcn-222纳米酶标记的非特异性单链ssdna，所述单链ssdna的核苷酸序列能够被激活的cas12a蛋白切割。

6、作为本发明所述基于纳米酶信号放大的电化学小分子生物传感器的一种优选方案，其中：所述单链dna的核苷酸序列长度为10～30nt。

7、作为本发明所述基于纳米酶信号放大的电化学小分子生物传感器的一种优选方案，其中：所述单链dna的核苷酸序列包括如seq id no.1所示的核苷酸序列。

8、本发明的再一目的是，提供一种电化学小分子生物传感器的制备方法。

9、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括，

10、将单链ssdna溶液滴加至预处理后的金电极100表面，干燥后用6-巯基乙醇溶液封闭非特异性结合部位，得到ssdna修饰的金电极100；

11、pd@pcn-222纳米酶溶液滴加于单链ssdna修饰的金电极100上，进行缩合反应，结合形成功能层200，即得到电化学小分子生物传感器。

12、作为本发明所述的电化学小分子生物传感器的制备方法的一种优选方案，其中：所述单链ssdna溶液的浓度为1～5μm，所述6-巯基乙醇溶液的浓度为2～3mm，所述pd@pcn-222纳米酶溶液的浓度为2～6mg/ml。

13、作为本发明所述电化学小分子生物传感器的制备方法的一种优选方案，其中：所述单链ssdna溶液、6-巯基乙醇溶液、pd@pcn-222纳米酶溶液的比例为3：2：4。

14、作为本发明所述电化学小分子生物传感器的制备方法的一种优选方案，其中：所述干燥的干燥温度为20～40℃，干燥时间为8～15h。

15、本发明的再一目的是，提供一种电化学小分子生物传感器在检测赭曲霉毒素a中的应用。

16、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括，

17、所述应用为通过生物传感器检测赭曲霉毒素a，其中，所述检测赭曲霉毒素a的方法包括，

18、将核苷酸序列如seq id no.2所示的适配体链与核苷酸序列如seq idno.3所示的互补链按照0.75:1～1.75:1的摩尔比混合加热形成双链dna；

19、双链dna与含赭曲霉毒素a的目标检测物共同孵育得到反应液；

20、反应液与浓度为10～130nm的crispr/cas12a体系溶液混合，得到待测液；

21、待测液加入到生物传感器的金电极100表面上反式切割6～60min，切割后将金电极100浸入缓冲液中，进行差示方波伏安分析，通过计算电流信号的变化，实现对赭曲霉毒素a的检测分析；

22、其中，所述crispr/cas12a体系包括，核苷酸序列如seq id no.4所示的crrna、cas12a蛋白、核糖核酸酶抑制剂、缓冲剂ii，体积比为0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：2。

23、本发明的再一目的是，提供一种用于检测赭曲霉毒素a的微流控芯片装置，所述微流控芯片装置由pmma芯片300和微流控智能平台400构成，其中，所述pmma芯片300具有若干测试单元a，所述测试单元a由顺序连通的反应区a-1、检测区a-2和废液区a-3构成；

24、其中，所述反应区a-1由容置样品溶液的第一反应室a-101、容置修饰有功能层200的金电极100的第二反应室a-102和容置crispr-cas12a系统溶液第三反应室a-103构成，所述第一反应室a-101、第二反应室a-102、第三反应室a-103顺序连通，所述第三反应室a-103与所述检测区a-2连通，其中，所述反应室均设置有进样孔a。

25、本发明的再一目的是，提供一种微流控芯片装置在检测赭曲霉毒素a中的应用，包括，

26、待测物的样品溶液和双链dna溶液通过进样孔a加入芯片反应区a-1的第一反应室a-101中，crispr-cas12a系统溶液加入第三反应室a-103中；

27、将装载上述溶液的pmma芯片300放入微流控智能平台400；

28、通过计时电流法进行电化学检测，检测前将修饰有功能层200的金电极100插入检测区a-2中，通过计算电流信号的变化，实现对赭曲霉毒素a的检测分析。

29、本发明有益效果：

30、(1)本发明电化学传感器的制备方法工艺简单、操作便捷、安全、成本低廉、无污染、制作效率高、pd@pcn-222作为功能型纳米材料具有过氧化物酶活性，制备的电化学探针，可减少工作电极制备步骤，提高电化学传感器的检测灵敏度。

31、(2)本发明的电化学传感器检测赭曲霉毒素a时，能够检测水体和植物源食品中的赭曲霉毒素a，具有稳定性高、使用寿命长、检测范围宽、检测极限低、抗干扰能力强，可代替天然酶及其他信号放大技术等优点，应用范围广，应用价值高。

技术特征：

1.一种基于纳米酶信号放大的电化学小分子生物传感器，其特征在于：所述传感器包括金电极(100)和修饰在所述金电极(100)反应端表面的功能层(200)；

2.如权利要求1所述的基于纳米酶信号放大的电化学小分子生物传感器，其特征在于：所述单链dna的核苷酸序列长度为10～30nt。

3.如权利要求1或2任一所述的基于纳米酶信号放大的电化学小分子生物传感器，其特征在于：所述单链dna的核苷酸序列包括如seq id no.1所示的核苷酸序列。

4.如权利要求1～3任一所述的电化学小分子生物传感器的制备方法，其特征在于：包括，

5.如权利要求4所述的基于纳米酶信号放大的电化学小分子生物传感器的制备方法，其特征在于：所述单链ssdna溶液的浓度为1～5μm，所述6-巯基乙醇溶液的浓度为2-3mm，所述pd@pcn-222纳米酶溶液的浓度为2～6mg/ml。

6.如权利要求5所述的电化学小分子生物传感器的制备方法，其特征在于：所述单链ssdna溶液、6-巯基乙醇溶液、pd@pcn-222纳米酶溶液的比例为3：2：4。

7.如权利要求4所述的电化学小分子生物传感器的制备方法，其特征在于：所述干燥的干燥温度为20～40℃，干燥时间为8～15h。

8.如权利要求1～3任一所述的电化学小分子生物传感器在检测赭曲霉毒素a中的应用，其特征在于：所述应用为通过生物传感器检测赭曲霉毒素a，其中，所述检测赭曲霉毒素a的方法包括，

9.一种应用如权利要求8所述的检测赭曲霉毒素a的方法的微流控芯片装置，其特征在于：包括权利要求8所述的检测所述微流控芯片装置由pmma芯片(300)和微流控智能平台(400)构成，其中，所述pmma芯片(300)具有若干测试单元(a)，所述测试单元(a)由顺序连通的反应区(a-1)、检测区(a-2)和废液区(a-3)构成；

10.如权利要求9所述的微流控芯片装置在检测小分子赭曲霉毒素a中的应用，其特征在于：

技术总结
本发明公开了一种基于纳米酶信号放大的电化学小分子生物传感器、微流控芯片装置及其制备方法和应用，成功构建了一种基于CRISPR/Cas12a及Pd@PCN‑222信号放大的快速检测小分子的电化学方法，通过将SH‑ssDNA与Pd@PCN‑222偶联结合Cas12a的反式切割来放大电化学信号；当CRISPR/Cas12a系统内待测DNA中存在目标DNA片段时，在crRNA的引导下能够激活Ca s12a蛋白，切割电极表面固定的非特异性Pd@PCN‑222‑SH‑ssDNA，并降低来自Pd@PCN‑222‑SH‑ssDNA的电化学信号，使用本发明提供的便携式电化学生物传感器，可实现低浓度的目标物检测，进一步表明该电化学生物传感器可以实现快速、简单的高灵敏度检测。

技术研发人员：吴丽娜,黄和,岳媛媛,吴成媛
受保护的技术使用者：南京师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11