阴道微生物的荧光染色液及检测阴道微生物的方法与流程

本公开大体涉及生物医学工程产业领域，具体涉及一种阴道微生物的荧光染色液及检测阴道微生物的方法。

背景技术：

1、女性阴道炎症的发病率约为13％，主要由生殖道感染所引发。阴道炎大致包括细菌性阴道病(bv)、外阴阴道假丝酵母菌病(vvc)、滴虫性阴道炎(tv)、需氧菌性阴道炎(av)、细胞溶解性阴道病(cv)和混合型感染等类型。阴道分泌物检查是诊断女性外生殖道感染最简单、最常用的检查手段。通过对女性阴道分泌物的外观、清洁度、上皮细胞、白细胞、各种细菌、真菌及寄生虫等的检查，对阴道内的微生态做出系统性评价，能够了解女性的健康状况。

2、目前各大医院和检测机构常用的检验方法为生理盐水湿片法，但该方法的在显微镜下观察难度大，需要有丰富经验的检验师，且结果主观性较强，不同检验师的判读结果存在差异性，假阴性或假阳性较高。另外还有革兰氏染色法，该方法的优点是细菌及真菌易于判断，但该方法影响因素多，可能造成漏诊，且操作比较繁琐、染色时间较长，难以满足快速出报告的要求。此外，还可采用传统培养方法对阴道分泌物进行检验，此方法需要根据临床初步诊断及待检细菌的种类，选择不同类型的培养基及环境进行培养，此种培养方法周期较长，对设备及环境要求严格，需要全套的微生物培养基鉴定设备，并且对操作人员的要求较高，限制了其临床应用。

3、近些年也出现了荧光染色液检测法，但目前荧光染色液检测法存在下列缺陷：染色效果较差，结果难以判断；检测操作时间较长，操作步骤繁琐，需要使用两种染色液依次进行两次染色。

技术实现思路

1、本公开是有鉴于上述现有技术的状况而提出的，其目的在于提供一种染色效果好、操作简便的阴道微生物的荧光染色液及检测人阴道微生物的方法。

2、为此，本公开的第一方面提供一种阴道微生物的荧光染色液，包括荧光剂、抗体、辅助染料、抑菌剂、防淬灭剂、表面活性剂和缓冲液；所述荧光染色液的ph为4.0至5.0，其中：所述荧光剂由第一荧光剂和第二荧光剂组成，其中：所述第一荧光剂为sybr greenⅰ或异硫氰酸荧光素，所述第二荧光剂为吖啶橙、碘化丙啶和多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物的至少一种；所述抗体为β-1,3-葡聚糖结合蛋白、肽聚糖识别蛋白、脂多糖抗体、脂磷壁酸抗体和肽聚糖抗体中的至少一种，且所述抗体与所述第二荧光剂偶联；所述辅助染料为甲基绿、亮绿、伊红、伊文思蓝和3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-翁氯化物的至少一种；所述抑菌剂为proclin 300、叠氮钠、山梨酸钾、异噻唑啉酮、庆大霉素、甲醛和多聚甲醛的至少一种；所述防淬灭剂为甘油、p-苯二胺、n-丙基没食子酸盐、1，4-二偶氮双环-辛烷、4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸n-丁二酰亚胺酯和抗坏血酸的至少一种；所述表面活性剂为tritonx-100或吐温。

3、在本公开第一方面的荧光染色液中，荧光剂包括第一荧光剂和第二荧光剂，能够通过第一荧光剂和第二荧光剂同时对阴道微生物的核酸进行染色，由此能够利用第一荧光剂和第二荧光剂不同的染色特性来获取更多的互补信息，例如可以区分不同的核酸结构(双链dna、单链dna或rna)，例如可以结合核酸和细胞表面分子的双重荧光进行结果判读，此外第一荧光剂和第二荧光剂能够协同作用，增加染色的强度和清晰度，提高染色效果，进而有助于增加检测的稳定性和灵敏度；通过使第一荧光剂为sybr greenⅰ或异硫氰酸荧光素，第二荧光剂为吖啶橙、碘化丙啶和多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物的至少一种，能够有利于提高染色效果；抗体能够与微生物的细胞壁或外膜中的成分特异性结合，有利于区分革兰氏阴性或阳性菌，从而有利于判断微生物的类型，且抗体与第二荧光剂偶联，由此能够使微生物的细胞壁或外膜发出荧光，使微生物的形态更加容易观察，从而有利于判断微生物的类型；辅助染料能够与目标微生物细胞壁、细胞膜等结构中的分子相互作用，形成染色复合物，使细胞或组织的结构更清晰可见，方便观察和分析，此外还能与荧光剂发生作用并改变荧光剂的荧光特性或染色特性，增强染色效果，从而有利于判断微生物的类型；抑菌剂能够减少荧光染色液中的微生物污染的情况，提高荧光染色液的稳定性，此外也能减少微生物污染带来的对待测样本的检测结果的干扰；防淬灭剂能够保护荧光染色液中的荧光剂和辅助染料，减少或抑制荧光信号淬灭，从而提高检测结果的准确性和可靠性；表面活性剂能够促进荧光剂和辅助染料的溶解和分散，此外表面活性剂还能够提高荧光剂和辅助染料的渗透性，降低细胞膜的表面张力，使荧光剂和辅助染料能够更易于穿透细胞膜以及核酸分子的空间结构，表面活性剂还能够改善核酸染色的效果，通过降低静电排斥力、改变化学环境等方式，增强染料与核酸的结合能力，最后表面活性剂还能够通过阻断非特异性结合位点，减少染料与非目标物质的结合，提高染色的特异性；缓冲液能够有助于调节荧光染色液的ph值、维持离子强度，能够稳定荧光剂和辅助染料的染色性能，以及提高抗体的稳定性；综上，本公开第一方面的荧光染色液，通过各组分之间的协同和相互作用，能够增强染色效果，提高检测准确性。使用本公开第一方面的荧光染色液对样本进行一次染色即可使样本具有良好的染色效果、达到识别需求，相较于多次染色的染色液来说更为便捷，能够简化操作流程。

4、在本公开第一方面所涉及的荧光染色液中，可选地，所述第一荧光剂为sybrgreenⅰ，所述第二荧光剂为吖啶橙，在所述荧光染色液中，sybr greenⅰ的浓度为0.01至1g/l，吖啶橙的浓度为0.01g/l至1g/l。在这种情况下，sybr greenⅰ能够结合至双链dna的双螺旋小沟区域，结合后荧光显著增强，sybr greenⅰ与双链dna结合呈现绿色荧光，如果含有单链dna则颜色为橘黄色；吖啶橙能够通过静电吸引和单链dna或rna结合，或者能够通过嵌入双链dna的碱基对之间和双链dna结合，当吖啶橙嵌合到双链dna分子中时显绿色，而与单链dna或rna结合时发桔黄色或橙红色荧光；在这种情况下，同时使用sybr greenⅰ和吖啶橙，能够利用两者不同的荧光特性，区分不同的核酸结构(双链dna、单链dna或rna)，此外，荧光共献效应可能导致sybr green i的荧光能量传递给吖啶橙，使得吖啶橙的荧光信号增加，有助于增强核酸的荧光信号，提高检测灵敏度；本公开中适宜浓度的sybr greenⅰ和吖啶橙能够有利于获得良好的染色效果和荧光共献效应强度。

5、在本公开第一方面所涉及的荧光染色液中，可选地，所述抗体为脂多糖抗体，在所述荧光染色液中，所述脂多糖抗体的浓度为0.001g/l至0.1g/l。在这种情况下，脂多糖抗体能够与革兰氏阴性菌外膜上的脂多糖特异性结合，由此能够有利于区分革兰氏阴性或阳性菌，且抗体与第二荧光剂偶联，由此能够使微生物的细胞壁或外膜发出荧光，使微生物的形态更加容易观察，从而有利于判断微生物的类型；本公开中适宜浓度的脂多糖抗体能够有利于获得良好的染色效果和检测准确性，浓度过低可能导致染色不明显或染色不均匀，浓度过高可能会导致非特异性结合。

6、在本公开第一方面所涉及的荧光染色液中，可选地，所述辅助染料为甲基绿，在所述荧光染色液中，甲基绿的浓度为0.01g/l至1g/l。甲基绿能够与荧光剂发生作用并改变荧光剂的荧光特性或染色特性，增强染色效果，从而有利于判断微生物的类型；本公开中适宜浓度的甲基绿能够有利于获得良好的染色效果，浓度过低可能导致染色效果不明显，不易观察和分析，浓度过高可能会产生背景染色，影响结果判断。

7、在本公开第一方面所涉及的荧光染色液中，可选地，所述抑菌剂为proclin 300，所述防淬灭剂为甘油，所述表面活性剂为triton x-100，所述缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液。在这种情况下，由于磷酸盐缓冲液易与常见的钙镁离子及一些重金属离子缔结形成沉淀，不利于染色液的长期保存，因此使用乙酸-乙酸钠缓冲液能够有利于染色液的长期保持。

8、在本公开第一方面所涉及的荧光染色液中，可选地，proclin 300的浓度为0.01g/l至1g/l，甘油的浓度为0.05g/l至5g/l，triton x-100的浓度为0.1g/l至1g/l，乙酸的浓度为0.05g/l至5g/l，乙酸钠的浓度为0.02g/l至2g/l。在本公开的荧光染色体中，适合浓度的抑菌剂，有利于达到良好的抑菌效果且能减少对染色剂和抗体的干扰，适合浓度的防淬灭剂，有利于增强染色效果；适合浓度的表面活性剂，有利于增强染色效果；适合浓度的缓冲液，有利于维持适合的ph范围和离子强度，增强染色效果。

9、本公开的第二方面提供一种检测阴道微生物的方法，包括：将待测样本载置于载玻片并进行干燥，得到干燥后的载玻片，其中所述待测样本为阴道分泌物样本；向所述干燥后的载玻片上加入固定剂进行固定，得到固定后的载玻片；向所述固定后的载玻片加入如本公开第一方面所述的荧光染色液进行染色，得到染色后的载玻片；将所述染色后的载玻片上进行干燥，得到待观测载玻片；使用荧光显微镜观察所述待观测载玻片，并判断得到所述待测样本中微生物的检测结果。本公开第二发明的检测方法中，使用了本公开第一方面提供的荧光染色液对阴道分泌物样本进行染色，能够具有良好的染色效果，此外本公开的检测方法，流程简便，无需使用多种染色液进行多次染色，能够有利于提高检测效率。

10、在本公开第二方面所涉及的方法中，可选地，通过使所述载玻片在50℃至60℃的温度下进行烘烤来进行干燥。由此，能够利用合适的温度对样本进行干燥，减少对样本结构的破坏。

11、在本公开第二方面所涉及的方法中，可选地，所述固定剂为无水甲醇或无水乙醇，固定时间为2分钟至3分钟。由此，能够有利于使微生物固定在载玻片上，以及有利于固定细胞的形态、细胞器的位置以及细胞内部的结构，从而能够便于染色和观察，此外细胞固定后能够有利于荧光剂进入细胞内与核酸结合。

12、在本公开第二方面所涉及的方法中，可选地，染色时间为30秒至60秒，所述荧光显微镜的激发波长为450nm至500nm。由此，能够有利于提高染色效果，进而有利于提高检测准确性。

13、根据本公开，能够提供一种染色效果好、操作简便的阴道微生物的荧光染色液及检测阴道微生物的方法。