一种集成多肽样本在线脱盐和离子化装置及其应用的制作方法

本发明涉及一种集成多肽样本在线脱盐和离子化装置及其应用，属于分析。

背景技术：

1、蛋白质和肽类是人体内重要的生物分子，常作为肿瘤、心脑血管疾病等重大疾病临床诊断分子。免疫分析方法具有快速高效的优点，在蛋白质和肽类诊断标志物的临床检测中已取得广泛的临床应用，但由于不可避免的免疫交叉反应和非特异性吸附，往往不同检测系统得到结果难以比较，易造成医疗资源浪费。因此，开发高准确度检测方法具有重要意义。

2、质谱技术具有高特异性、高灵敏的优势，近年来得到临床工作者的广泛关注。尤其是蛋白质酶切-同位素稀释质谱技术已成为目前公认的准确方法，以同位素标记的蛋白酶切特征肽为内标，实现多种蛋白标志物的绝对定量和标准物质研制。然而现有蛋白质和肽类分子的质谱检测方法通常需要结合固相微萃取/超滤脱盐、真空浓缩富集、液相色谱分离等系列复杂前处理操作，成本高且耗时长，难以用于大规模分析，尚未进入临床市场。降本增效是提升质谱技术的临床应用潜力的关键。

3、已有研究开发蛋白质组学微量样本制备装置，可用于微量蛋白酶解多肽产物的脱盐富集，进一步通过液相色谱串联质谱技术(lc-ms)实现微量蛋白质组学样本分析，目前这项技术已在蛋白质组学研究中取得广泛应用。然而该方法依旧依赖于液相色谱平台，且离线前处理过程会造成样本的损失。相比于传统lc-ms分析技术，直接质谱分析更简单快速，且不损失检测灵敏度，在样品快速检测领域展现出独特优势，有望成为临床质谱检测的重要工具。因此，集成多肽在线处理和直接质谱分析方法，有望减少前处理步骤，降低目标肽损失，实现蛋白质和肽类疾病标志物的快速准确测量。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种集成多肽样本在线脱盐和离子化装置，避免了多肽分析对固相微萃取、超滤、真空浓缩、液相色谱分离等复杂前处理制备仪器和操作步骤的依赖，可轻松实现微量多肽样本的脱盐、富集、分离和电喷雾离子化；本发明装置与质谱结合，可实现多组分肽的定性定量分析，应用于蛋白质和多肽类疾病标志物的快速准确测量。

2、本发明提供的集成微量多肽样本在线脱盐和离子化装置，包括毛细管探针；

3、所述毛细管探针的两端开口，其头部为尖端开口，尾部用于与气路连接，可与大气压或高压气体相连；

4、所述毛细管探针外环绕电极作为高压电接口；

5、所述毛细管探针的头部设有分离柱，所述分离柱为c8膜-c18微球颗粒-c8膜形成的三层结构。

6、本发明在线脱盐和离子化装置中，所述毛细管探针可为玻璃毛细管探针；

7、所述玻璃毛细管探针可由等径玻璃管拉制而成，玻璃毛细管材质为硼硅酸盐玻璃；

8、所述尖端开口的直径为2～20μm。

9、本发明在线脱盐和离子化装置中，所述c8膜来源为商品化empore固相萃取膜片，在毛细管探针内厚度为1～5mm；

10、所述c18微球颗粒的质量为0.1～5mg，粒径为2～20μm；

11、所述分离柱可按照下述方法进行制备：

12、步骤一：将所述c8膜从所述毛细管探针的尾部压入，使其在所述毛细管探针的尖端处厚度达到1～5mm；步骤二：将所述c18微球填料均匀分散在甲醇等有机溶液中并从所述毛细管探针的尾部加入，在氮气作用下累积在尖端；步骤三：重复步骤一，压实后得到包含三层结构在线分离柱。

13、本发明在线脱盐和离子化装置中，所述电极为金属材料，导电性能良好；

14、所述高压电接口用于与高压电源相连。

15、本发明提供的在线脱盐和离子化装置能够用于微量多肽样本的脱盐和富集以及离子化，具体步骤如下：

16、s1、对所述在线脱盐和离子化装置进行活化和平衡处理；

17、s2、将待测多肽样本的溶液加入至所述在线脱盐和离子化装置中；

18、s3、依次加入清洗液和洗脱液；

19、所述清洗液为含有机酸的水溶液；

20、所述洗脱液为含有机酸的乙腈水溶液，，其另一功能是作为电喷雾溶剂；

21、所述乙腈水溶液中乙腈的体积含量为20％～100％；

22、所述有机酸为甲酸、乙酸或tfa，其质量分数为0～1％，优选0.1％的甲酸；

23、步骤s1中，所述活化采用的活化剂为甲醇或乙腈，用量至少为10倍柱体积，活化三次；

24、所述平衡采用的平衡液包括平衡液1和平衡液2，所述平衡液1为体积含量为20～80％的所述活化剂的水溶液，所述平衡液2为含有机酸的水溶液，用量至少为10倍柱体积，平衡三次；

25、所述有机酸为甲酸、乙酸或tfa，其质量分数为0～1％，优选0.1％的甲酸。

26、在活化和平衡过程中，氮气辅助溶液置换，以达到脱盐和富集的效果。

27、经脱盐和富集以及离子化的多肽样本可直接进行质谱分析，具体步骤如下：

28、将所述毛细管探针置于质谱仪的进样口前，将所述毛细管探针的尾部与空气或氮气相连，在所述电极上施加直流电压或脉冲电压，使待测溶液发生电喷雾离子化，即可采集质谱数据，实现质谱分析；

29、所述毛细管探针的尖端开口与所述进样口的配合方式如下1)或2)：

30、1)所述毛细管探针的尖端开口与所述进样口持平，水平距离为1～10mm；

31、2)所述毛细管探针与所述进样口成0～60度的夹角；

32、所述流电压或脉冲电压的电压范围为-8kv～+8kv；

33、本发明涉及的多肽样本可为肽纯溶液、肽混合物或蛋白质酶切产物。

34、本发明提供的集成纳升电喷雾离子化器的多肽样本前处理探针(peptidesampling probe coupled with nanoelectrospray ionization，psp-nesi)，可基于反相色谱分离原理去除蛋白质酶解产物中缓冲盐等干扰基质，并实现不同极性酶切肽段的在线分离和离子化。本发明设置的毛细管探针，因其独特的结构即可用于多肽样本脱盐前处理，也可直接作为电喷雾探针，极大降低了复杂蛋白质样本质谱分析的复杂度，且其分离和检测效果可与常规lc-ms分析媲美，检测灵敏度低至ppb水平，有望应用于蛋白类疾病标志物的快速筛查等。本发明提供的微量蛋白样本在线脱盐及离子化装置及其应用方法，能够取得以下有益效果：

35、1、可实现多肽样本在线脱盐和电喷雾离子化，避免了蛋白质组学、多肽质谱分析样本前处理过程中的多次转移，减少样本损失。

36、2、装置的制作工艺简单，成本低廉，经过简单溶剂置换即可轻松实现微量多肽样本的脱盐、富集、分离和纳升电喷雾质谱分析，避免了对高速离心机、液相色谱仪等精密仪器设备的依赖。

37、3、使用便捷，适用范围广。与柱内酶切结合，可实现目标蛋白特征肽段的快速检测。与同位素稀释质谱法结合，提前加入已知量内标，可实现多肽的绝对定量。可作为低丰度蛋白质及多肽类疾病标志物的快速、准确测量的有效手段。

技术特征：

1.一种集成微量多肽样本在线脱盐和离子化装置，包括毛细管探针；

2.根据权利要求1所述的在线脱盐和离子化装置，其特征在于：所述毛细管探针为玻璃毛细管探针；

3.根据权利要求1或2所述的在线脱盐和离子化装置，其特征在于：所述疏水性c8膜的厚度为1～5mm；

4.根据权利要求1-3中任一项所述的在线脱盐和离子化装置，其特征在于：所述电极为金属材料；

5.权利要求1-4中任一项所述在线脱盐和离子化装置在多肽样本前处理中的应用。

6.一种多肽样本的脱盐和富集以及离子化方法，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的脱盐和富集以及离子化方法，其特征在于：步骤s1中，所述活化采用的活化剂为甲醇或乙腈；

8.权利要求1-4中任一项所述在线脱盐和离子化装置在多肽直接质谱分析中的应用。

9.一种多肽直接质谱分析的方法，包括如下步骤：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤sb中，所述毛细管探针的尖端开口与所述进样口的配合方式如下1)或2)：

技术总结
本发明公开了一种集成多肽样本在线脱盐和离子化装置及其应用。所述在线脱盐和离子化装置包括毛细管探针；毛细管探针的两端开口，其头部为尖端开口，尾部用于与气路连接；毛细管探针外环绕电极作为高压电接口；毛细管探针的头部设有分离柱，分离柱为C8膜‑C18微球颗粒‑C8膜形成的三层结构。本发明装置能够用于微量多肽样本的脱盐和富集以及离子化、对多肽直接进行质谱分析。本发明装置避免了多肽分析对固相微萃取、超滤、真空浓缩、液相色谱分离等复杂前处理制备仪器和操作步骤的依赖，可轻松实现微量多肽样本的脱盐、富集、分离和电喷雾离子化。本发明装置与质谱结合，可实现多组分肽的定性定量分析，应用于蛋白质和多肽类疾病标志物的快速准确测量。

技术研发人员：姚欢,崔新玲,李红梅
受保护的技术使用者：中国计量科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1