一种用于活动性结核诊断的试剂盒、制备方法和检测方法与流程

本发明属于生物医学，具体涉及一种用于活动性结核诊断的试剂盒、制备方法和检测方法。

背景技术：

1、据世界卫生组织数据显示，全球三分之一的人口潜伏感染结核分支杆菌，其中约10％的人可能发展成活动性结核。缺乏早期标志物的快速诊断、治疗和传染源的有效控制导致结核病直接或间接快速传播是关键原因其中之一。

2、现有技术中临床大多数结核病诊断技术依赖细菌学结核菌涂片和培养作为诊断结核的金标准；分子生物学gene xpert、tb-dna检测快速具有较高的敏感性和特异性，但受痰样本的限制；igras检测结核分枝杆菌特异性抗原刺激产生γ-干扰素，鉴别是否结核分枝杆菌感染，无法区分活动性结核和潜伏性结核。流式cd161检测技术只在菌阴、hiv合并感染、部分结核病人无痰或儿童领域能够辅助诊断；另一种基于尿液的生物标志物脂阿拉伯甘露聚糖lam被世卫组织视为有效，在hiv合并结核病有较好的特异性；临床微创支气管纤维镜检查的开展，更直观了解结核分枝杆菌引起的肺部病灶，其中病理组织学检测和肺泡灌洗液的结核菌培养可提高无痰患者、痰涂片阴性患者的检出率；然而，即使采用上述多种检测方法在诊断活动性结核方面的检出率也不足50％，其主要原因受样本限制、高端检测平台无普及优势、价格高昂、辅助性诊断局限等因素。

3、现有技术中缺少一种检测血清或血浆中的生物标志物作为痰标本的替代方案的高危人群结核病诊断方法。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种用于活动性结核诊断的试剂盒、制备方法和检测方法，通过检测血清或血浆中的生物标志物作为痰标本的替代方案作为高危人群结核病诊断方法；化学发光试剂盒检测mmp-8常用的标志物，能有效快捷且特异性区别活动性结核和潜伏感染者、健康人群，并能鉴别潜伏感染者和健康人群；操作方便，检测周期短，灵敏度高，普适性好。

2、本发明所采用的技术方案为：

3、第一技术方案提供一种用于活动性结核诊断的试剂盒,包括有基质金属蛋白酶mmp-8。

4、进一步地，包括有标志物抗体对、阳性对照、阴性对照、抗体标准品、质控品、磁性微球、发光标记物、荧光素标记物、n-(4-氨丁基)-n-乙基异鲁米诺发光标记物(abei)，和样本特异性刺激多肽混合物。

5、进一步地，包括有包被标志物抗体的磁球悬浮溶液、发光标记物、荧光素标记物、低点校准品、高点校准品和质控品；

6、所述发光标记物包括有抗mmp-8单克隆抗体标记abei、含牛血清白蛋白和0.2％nan3；

7、所述荧光素标记物包括有抗mmp-8单克隆抗体标记fitc、含牛血清白蛋白和0.2％nan3。

8、进一步地，所述磁球悬浮溶液包括有mes缓冲液、0.2％nan3和包被羊抗fitc单克隆抗体；

9、所述低点校准品、高点校准品、质控品分别包括有含牛血清白蛋白和0.2％nan3。

10、本发明第二技术方案提供一种用于活动性结核诊断的试剂盒制备方法,使用上述之一的用于活动性结核诊断的试剂盒，包括以下操作步骤：

11、s01，制备含有包被标志物抗体的磁球悬浮溶液；

12、s011，将磁性微球中悬浮于ph5.5 mes缓冲液中，磁性微球在缓冲液中的浓度为20mg/ml以上；

13、s012，再加入磁珠微球edc，使其磁珠微球edc浓度为10mg/ml以上，得到初混悬浮液；

14、s013，在初混悬浮液中加入包被抗体，初混悬浮液的重量为包被抗体的重量的40倍以上；放入恒温震荡水浴箱中37℃温度条件下反应2小时，得到温育后的中混悬浮液；

15、s014，将中混悬浮液倒入烧杯中，然后置于磁铁上沉淀后，倒掉上清，加入剩余液体5倍体积的磁球清洗液，进行搅拌清洗，得到再混悬浮液；

16、s015，然后将再混悬浮液放置在磁铁上，待上清液清亮后倒掉上清液；

17、s016，重复s014～s015清洗步骤至少3次，得到清洗完成的磁球；

18、s017，将清洗完成的磁球加入包被体积的重悬缓冲液中，悬浮浓度为20mg/ml以上，形成包被体积的磁球悬浮液；

19、s018，得到包被一抗的磁球悬浮溶液；

20、s02，制备标记有发光标记物的抗标志物抗体；

21、s021，取1mg抗标志物抗体，少量多次添加透析液溶解，直到获得1ml抗标志物抗体溶解液；

22、s022，将抗标志物抗体溶解液放入透析袋中，搅拌透析2h；得到透析好的抗标志物抗体透析溶解液；

23、s023，将抗标志物抗体透析溶解液加入100μg abei-nhs，在37℃温度条件下反应2h，得到标记abei的抗标志物抗体溶液；

24、s024，以g-25凝胶柱纯化上述得到的标记abei的抗标志物抗体溶液，简称发光标记物；

25、s03，制备荧光素标记物；

26、s031，取1mg抗标志物抗体标记荧光素，少量多次添加透析液溶解，直到获得1ml荧光素溶解液；

27、s032，将抗标志物抗体溶解液放入透析袋中，搅拌透析2h；得到透析好的抗标志物抗体透析溶解液；

28、s033，将抗标志物抗体透析溶解液加入荧光素溶解液，在4℃温度条件下反应24h，得到抗单克隆抗体标记fitc荧光素标记物，简称荧光素标记物；

29、s04，制备试剂盒；

30、将磁球悬浮溶液、发光标记物、荧光素标记物、低点校准品、高点校准品和质控品分装到全自动化学发光免疫分析仪的仪器专用试剂盒中。

31、进一步地，所述步骤s03中还包括以下操作内容：

32、s034，验证检测效果；

33、s0341，采用一株抗标志物单克隆抗体包被磁性微球，作为捕获抗体；采用abei发光剂标记另外一株抗标志物单克隆二抗，作为检测抗体；

34、s0342，采用校准品或者质控品作为样本；

35、s0343，将样本、缓冲液、磁性微球一起孵育15min，使得样本中的待检抗原与磁性微球包被的单克隆抗体结合；

36、s0344，通过磁分离清洗去除未结合的物质；

37、s0345，加入发光标记物再次进行孵育；

38、s0346，使得abei标记的另一株抗标志物单克隆二抗与已经结合于磁性微球上的复合物反应；

39、s0347，再次进行磁分离清洗去除未结合的物质；

40、s0348，加入全自动免疫检验系统用底物液，启动化学发光反应，产生光信号；通过光电倍增管测出的相对光强度(rlu)与样本中的标志物浓度的比例关系，通过标准曲线回归性分析，将相对光强度换算成最终浓度值；

41、s0349，将针对包被抗体、检测抗体检测计算的最终浓度值与针对已知蛋白检测计算的最终浓度值进行对比，判断捕获抗体、检测抗体的检测效果准确性符合要求。

42、进一步地，所述步骤s0342中还包括以下操作内容：

43、s03421，定标；

44、通过测定试剂盒低点校准品、高点校准品，将预先定义的试剂盒主曲线调整为一个新的、仪器特异的工作曲线。

45、进一步地，所述步骤s0342中还包括以下操作内容：

46、s03422，分析；

47、将样本装载到全自动化学发光免疫分析仪中，在仪器软件中编辑样本信息及测试项目，然后点击“开始”按钮，仪器按分析程序进行试验；试验参数均存储记录在试剂盒的全自动试剂芯片标签中。

48、进一步地，所述步骤s0342中还包括以下操作内容：

49、s03423，结果计算；

50、检测过程中，用定标的检测信号调整储存的主曲线到工作曲线，仪器借助工作曲线以及样本中分析物的检测信号，即相对光强度，计算每个样本中的被分析物浓度。

51、最后，本发明第三技术方案提供一种基于病理染色测定肺内外结核病的试剂盒检测方法，使用第一技术方案之一所述的用于活动性结核诊断的试剂盒，包括以下操作步骤：

52、p01，待测样本制备和收集；

53、p011，特异性多肽刺激物：用dmso溶解多肽冻干粉，充分混匀溶解，快速离心备用；

54、p012，待测样本制备：抽取患者肝素抗凝3ml全血，加入混合多肽刺激物10ug/ml浓度，充分混匀，37℃温度条件下放置10％二氧化碳孵育箱培养16-18小时，次日按照2000转/分钟的转速离心5分钟，上机检测；

55、p02，化学发光操作流程；

56、p021，试剂制备：提前平衡试剂30分钟，使得磁性微球在检测前充分混匀；配备足够的底物液、反应杯、清洗液，清空废物和/或废液；

57、p022定标：通过测定高点校准品、低点校准品，将预先定义的试剂盒主曲线调整为新的特异的工作曲线；绘制标准曲线，计算回归分析中的回归相关系数r2＝0.9900以上，通过发光值线性回归方程计算出因变量y值，即实测值；

58、p023，质量控制：质控要求参照各实验室规定，每天检测前，新的试剂盒前都需重新检测质控；质控结果必须在检测范围内，质控品的性能在使用前应预先评估，并建立合适的质控范围；

59、p024，检测过程：按全自动化学发光免疫分析仪仪器程序设定，首先加入20ul标志物磁性微球，加入80ul制备好的样本至反应杯，再加入40ul发光标记磁性微球，加入40ul酶标记的底物，混匀温育15分钟；加入400ul清洗液清洗一遍，最后加入过氧化氢还原，激发发光物，记录特异发光值；

60、p025，分析程序：全自动化学发光免疫分析仪按设定程序收集试验参数，进行系统性评估和分析，试验参数包括加样量、温育、清洗、测量信息和发光值；

61、p026，计算结果：根据定标检测值绘制的标准曲线，分析样本中分析物的检出信号和相对发光强度，计算每个样本的分析物浓度，单位ng/ml。

62、p027，按照经验参考值标准根据计算结果进行对比判断。

63、本发明的有益效果为：

64、一种用于活动性结核诊断的试剂盒、制备方法和检测方法，试剂盒的试剂包括包被标志物抗体的磁球悬浮液、发光标记物、荧光素标记物、低点校准品、高点校准品和质控品，化学发光试剂盒检测mmp-8常用的标志物，能有效快捷且特异性区别活动性结核和潜伏感染者、健康人群，并能鉴别潜伏感染者和健康人群；能够满足特殊人群检测需求，如免疫低下hiv合并、免疫抑制和妇幼人群等，不受样本的限制，实现快、准、特异性高效能等实用优点，可全面自动化和可靠重复性值得在实验室应用推广。建立检测血清或血浆中的生物标志物作为痰标本的替代方法，用于预测早期活动性结核诊断及潜伏筛查的新方法。操作方便，检测周期短，灵敏度高，普适性好。