利用核靶向与质靶向碳点定量细胞核质比的方法及其应用

本发明属于医学成像材料，具体涉及利用核靶向与质靶向碳点定量细胞核质比的方法及其应用。

背景技术：

1、组织病理学检测是诊断与区分肿瘤组织与正常组织的常用方法，目前he染色方法依然是肿瘤诊断的金标准，在临床上被广泛和普遍使用，可以观察到整个组织切片上的细胞核，细胞膜，细胞质等细胞的形态学结构，能够很好显示病理组织的异常增生细胞的核肿大，核分裂畸变，核浆比失调等病理学特征。但he染色中使用到的苏木精产量有限，价格昂贵。使用液配制繁琐耗时，因此需要制备简便的纳米材料来对组织切片进行染色分析。

2、免疫荧光染色与免疫组织化学染色能够使得肿瘤组织切片表现出好的荧光染色效果，但染色过程繁琐两者都是蛋白定位的检测(也就是确定蛋白是表达在细胞核/浆/膜)，酶免疫组化方法较为复杂,多了dab显色过程，免疫荧光组织化学技术是采用荧光素标记的已知抗体(或抗原)作为探针，荧光素具有快速漂白褪色情况，不利于较长时间保存于观察。

3、碳量子点cqds与传统的半导体量子点及染料相比，具有非重金属的化学组成、温和的功能化反应、可调谐的荧光发射及光催化稳定性包括不易发生光漂白和眨眼现象。生物相容性好，靶向性明显，纳米颗粒微小可以很好地穿透组织与细胞。目前已有研究只说明了靶向碳点在细胞成像方面的能力，靶向碳点在组织切片上染色情况与染色信息还没有文献明确说明，本发明就碳点在组织切片上的应用进行了研究。

4、针对不同肿瘤组织，组织切片上细胞形态，判断依据各异，需要医师较高的医学知识与医学经验，靶向不同区域的纳米材料能够更好的区分组织切片细胞形态及肿瘤趋势，同一切片上标识出肿瘤细胞与正常细胞能提高肿瘤类型与诊断的可靠性。

5、目前医生对肿瘤组织切片的诊断主要通过细胞核形态，癌细胞核可比正常大1-5倍。但核膜不内折。由于各个癌细胞核增大程度不一致，同一视野的癌细胞核，大小相差悬殊。癌细胞核可出现明显的畸形，表现为细胞核形态不规则，呈结节状、分叶状等，核膜出现凹陷、皱褶，使核膜呈锯齿状。由于癌细胞核染色质增多，颗粒变粗，核深染，有的可呈墨水滴样，同时因核内染色质分布不均，核的染色深浅不一。超过细胞体积的增大，癌细胞核增大明显，故核质比例失常。并且癌细胞分化愈差，核质比例失常愈明显。此外，细胞核染色质边移，出现巨大核仁，异常核分裂，以及细胞体积增大，且大小不等，并出现梭形、蝌蚪形、星形等异常形态，以此作为癌细胞的辅助诊断依据。

技术实现思路

1、本发明针对目前组织切片染色过程繁琐，原料成本高，荧光漂白存在局限性等问题，提供了一种利用核靶向与质靶向碳点定量细胞核质比的方法及其应用，进一步的是在组织切片染色中的应用以及在定量检测细胞核质比中的应用。

2、本发明由如下技术方案实现的：利用核靶向与质靶向碳点定量细胞核质比的方法，取预先脱蜡水化处理的组织切片，脱水处理后使用核靶向荧光碳点与质靶向荧光碳点溶液分别进行染色，观察荧光成像，利用imagej软件对染色进行分析以确定细胞质与细胞核相应位置，并计算核质比。

3、核靶向碳点的制备方法为：在快速搅拌下将3g柠檬酸ca和1.5g聚乙烯亚胺pei1800溶解在30ml去离子水中以形成无色混合溶液；将混合溶液在300℃下加热反应6h，自然冷却至室温后，产物12000 rpm离心，以截留分子量500-1000的条件用去离子水透析纯化上清液24h即可获得核靶向碳点。

4、质靶向碳点的制备方法为：300mg邻苯二胺超声溶解在10ml去离子水中，900mg聚乙烯醇pva磁力搅拌溶解在20ml去离子水中，在快速搅拌下将邻苯二胺的水溶液和聚乙烯醇的水溶液混合形成混合溶液；将混合溶液在185℃下加热反应8h；自然冷却至室温后，将产物以12000 rpm离心，以截留分子量500-1000的条件用去离子水透析纯化上清液24h即可获得质靶向碳点。

5、预先脱蜡水化处理的组织切片分别浸渍在无水乙醇、质量分数为95%的乙醇溶液和质量分数为70%的乙醇溶液中，每次5min，然后用pbs洗净；在组织切片的表面滴加已经定好浓度的碳量子点溶液，在湿润环境下静置15min，然后用pbs洗净；取盖玻片直接加盖经染色后的载玻片，最后荧光显微镜下以420nm～540nm的波段进行观测镜检，查看组织切片中细胞的形态及荧光强度。

6、所述核靶向荧光碳点与质靶向荧光碳点溶液浓度为分别为150-500µg/ml。

7、进一步的，所述核靶向荧光碳点与质靶向荧光碳点溶液浓度为分别为500µg/ml。

8、本发明还提供了所述利用核靶向与质靶向碳点定量细胞核质比的方法在组织切片染色中的应用，预先脱蜡水化处理的组织切片用核靶向荧光碳点与质靶向荧光碳点溶液染色15min，核靶向荧光碳点与质靶向荧光碳点溶液浓度为分别为500µg/ml，组织切片染色后的图像通过酶标仪获得。组织切片染色后，细胞核发黄色荧光，细胞质发红色荧光。

9、本发明还提供了所述的方法在定量检测细胞核质比中的应用，将碳点作为染色材料用于组织切片后，在imagej软件中使用trainable weka segmentation插件对切片荧光成像进行基于机器学习的自动分割，对细胞核，细胞质及组织纤维背景进行自动划分，进而测量不同组织与相应正常组织切片的核质比进行比较，具体方法为：

10、（1）在imagej中打开一张由荧光显微镜拍摄的经过碳点染色的组织切片图像，打开trainable weka segmentation，点击create new class增加分类将图片分为细胞核，细胞质与组织纤维背景三类；

11、（2）利用freehand selections分别手动框选不同区域，添加到各自的分组，以此作为机器学习的训练集，精确的标记细胞核，细胞质与组织纤维背景特有的像素点；

12、（3）点击train classifier对整张图像进行机器学习的自动分割，红色标注细胞核，绿色标注细胞质，紫色标注组织纤维背景；

13、（4）当出现细胞核或者细胞质连成串，间隔没有完全分割出来的情况时进行修正处理，在分割有误的地方继续标注，增加训练集后重新训练分类器；

14、（5）将数据导出得到三色分割图来区分细胞核，细胞质，组织纤维背景；点击getprobability，得三个通道的分割图，在分割图上选择roi区域后应用于细胞核与细胞质分割图上，对分割图分别进行阈值设定，选定区域面积计算获得roi区域上细胞核面积与细胞质面积，进而来计算组织切片的核质比。

15、与现有技术相比，本发明所制备的具有细胞核靶向功能和细胞质靶向功能碳量子点，对其荧光性能与化学键进行标识，进而确定碳点可能存在的性能。碳点包括细胞核靶向与线粒体靶向两种并具有良好的光致发光特性，高的荧光量子产率。并对其在肿瘤细胞中的成像效果进行研究，研究结果表面：该碳量子点具有很好的细胞成像能力和较好的荧光稳定性。

16、对其在肿瘤组织切片中的成像效果进行了研究，研究结果显示：该碳量子点对组织切片染色步骤简单，染色效率高（15分钟）可靶向进入细胞核与细胞质，荧光强度稳定信号清晰，因此该碳点应用于组织切片染色材料具有实际意义。使用imagej对图像进行处理分析，使用基于机器学习的自动分割根据图像中特点确认细胞核与细胞质位置进而确定核质比，荧光强度，细胞核染色情况鉴别肿瘤组织与正常组织。