用于中国黄牛早期妊娠诊断的蛋白标志物及其诊断方法

本发明涉及用于中国黄牛早期妊娠诊断的蛋白标志物及其诊断方法，属于生物技术诊断领域。

背景技术：

1、黄牛广泛分布于中国各省及自治区，主要有秦川牛、晋南牛、鲁西牛、延边牛、温岭高峰牛。其肉质鲜美，极受当地人欢迎。但随现代化的快速发展，中国黄牛繁殖效率低下的问题日渐突出，造成种子资源流失，急需扩繁育种保护。现今，母牛生育力低下的因素主要来源于两点：饲养环境差，饲料配比不对；牛户专业能力低，检测技术落后。其中母牛早期妊娠诊断准确是确保妊娠的重中之重，牛早孕检测试纸是相对便捷的一种方法，也是现下牛早孕检测的主流。现今中国黄牛早期妊娠的分子调控机制尚不甚清楚，对于精准、简便、快捷的妊娠诊断技术开发在中国牛业生产中显得十分迫切。

2、母牛早期妊娠具有很高的妊娠流失率。在0(受精)～7天，受精卵经过一系列有丝分裂进入子宫角，这个阶段早期胚胎会通过分泌一些特殊因子与母体建立初步交流，若受精卵质量不合格和母体并未达到妊娠的状态都会造成胚胎流失，大约有25％～30％受精卵丢失。7天左右开始着床，而7～16天期间子宫内膜增厚，胚胎分泌旺盛，是早期胚胎-母体更深一步交流的阶段，这一阶段约15％～20％早期胚胎因母体排斥过剧而发生流产。在妊娠进行的17～21天是胚胎-母体rna转录和蛋白质翻译的巅峰时期，但受到母体免疫应答排斥增加，仍有5％～10～的早期胚胎可能会丢失。随后妊娠状态趋向于稳定，在28天左右通过早孕特殊蛋白可以判断是否妊娠，是现今牛早孕试纸技术检测的时间节点。另外，母牛的发情期大约21天为一周期，所以受精后21天是妊娠诊断的一个重要的临界点，也是早期胚胎蛋白表达旺盛的时期，现今早期妊娠21天的诊断检测技术仍是攻克的难关。

3、母牛孕早期分泌的特殊蛋白对维持妊娠稳定有着主要的意义。有研究表明荷斯坦奶牛怀孕21天和发情末期的牛乳清蛋白，发现四种蛋白apob，spadh1，plin2 and lpo有表达差异(p<0.05)，而中国独有的黄牛却鲜有研究报道。高通量测序技术分析在寻找妊娠生物标志物中有着开创性的意义，可以直观的比较怀孕前后的蛋白图谱，筛选出具有差异表达的蛋白标志物。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，解决黄牛早期妊娠诊断的血清蛋白标志物研究缺乏的问题，提供一种可用于21天中国黄牛早期妊娠诊断的蛋白标志物及其诊断方法。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：用于中国黄牛早期妊娠诊断的蛋白标志物，所述蛋白标志物包括如下蛋白中的一种或多种组合：

3、fgb蛋白，其序列如氨基酸序列seq id no.1所示；

4、c4bpa蛋白，其序列如氨基酸序列seq id no.2所示。

5、所述fgb蛋白在母牛妊娠21天时的血清中表达显著上升。

6、所述c4bpa蛋白在母牛妊娠21天时的血清中表达显著下降。

7、所述fgb蛋白在母牛受精后21天的血清中表达量上升不低于60％。

8、所述c4bpa蛋白在母牛受精后21天的血清中表达量下降不低于30％。

9、一种用于中国黄牛早期妊娠诊断方法，包含以下步骤：

10、s101、血液样本采集：采集母牛妊娠0天以及指定天数的血液样本；

11、s102、血清测序：将上述血液样本的血清进行测序分析，在鉴定到的蛋白质中筛选出差异蛋白，将该差异蛋白确定为妊娠诊断用的蛋白标志物，所述蛋白标志物为权利要求1所述的蛋白标志物；

12、s103、妊娠诊断：随机采集母牛受精后0天以及指定天数的血液样本，根据该蛋白标志物的表达情况来判断母牛是否妊娠。

13、所述步骤s102中差异蛋白的筛选方法如下：在鉴定到的蛋白质中，按照显著性p极低且差异倍数fc极大的标准筛选出符合条件的差异蛋白，所述显著性p极低为p＜0.05，所述差异倍数fc极大为fc＞1.2或fc＜0.833。

14、所述步骤s101中的指定天数和步骤s103中的指定天数相同，其中，步骤s101中的指定天数为母牛妊娠后第21天，步骤s103中的指定天数为母牛受精后第21天。

15、所述步骤s103中的判断方法为：当fgb蛋白在母牛受精后21天血清中的表达量相对于受精后0天时血清中的表达量上升不低于60％和/或c4bpa蛋白在母牛受精后21天血清中的表达量相对于受精后0天时血清中的表达量下降不低于30％时，诊断母牛此时已妊娠。

16、本申请针对中国黄牛早期妊娠21天血清蛋白成分进行测序分析，最终得到14个差异蛋白。本申请选了显著性极低和差异倍数极大的两个蛋白，即：fibrinogen beta chain(fgb)和c4b-binding protein alpha-like(c4bpa)。经过测序血清和随机筛选血清21天和0天的比较，证实fibrinogen beta chain(fgb)在牛早期妊娠21天时有着明显的上升的趋势，而c4b-binding protein alpha-like(c4bpa)在牛早期妊娠21天时有着明显的下降的趋势。

17、本申请利用哺乳动物妊娠前后生理水平发生这明显的变化，这些生理变化对妊娠维持具有极其重要的意义。而蛋白水平在分子水平上相对于代谢水平和转录组水平都有着更高的稳定性，更利于结果普及适用性。高通量测序技术对于广筛差异表达的蛋白有着绝对的优势，通过对母牛妊娠前后0天和21天的血清测序而筛选出差异蛋白。通过显著性大小和差异倍数大小的标准进行再筛选，筛选出更为稳定的血清差异蛋白(p值最小，fc值明显)。最后所筛选的血清差异蛋白进行牛群扩展检测以确保数据的可靠性。最终，确定为中国黄牛早期妊娠血清蛋白标志物。

18、本发明的有益效果是：筛选出了显著性极低和差异倍数极大的两个蛋白即fibrinogen beta chain(fgb)和c4b-binding protein alpha-like(c4bpa)作为中国黄牛早期妊娠血清蛋白标志物，解决了黄牛早期妊娠诊断的血清蛋白标志物研究缺乏的问题，可在黄牛受精后21天的血清中直接得到妊娠的诊断结果。

技术特征：

1.用于中国黄牛早期妊娠诊断的蛋白标志物，其特征在于，所述蛋白标志物包括如下蛋白中的一种或多种组合：

2.根据权利要求1所述的用于中国黄牛早期妊娠诊断的蛋白标志物，其特征在于，所述fgb蛋白在母牛妊娠21天时的血清中表达显著上升。

3.根据权利要求1所述的用于中国黄牛早期妊娠诊断的蛋白标志物，其特征在于，所述c4bpa蛋白在母牛妊娠21天时的血清中表达显著下降。

4.根据权利要求1或2任一所述的用于中国黄牛早期妊娠诊断的蛋白标志物，其特征在于，所述fgb蛋白在母牛受精后21天的血清中表达量上升不低于60%。

5.根据权利要求1或3任一所述的用于中国黄牛早期妊娠诊断的蛋白标志物，其特征在于，所述c4bpa蛋白在母牛受精后21天的血清中表达量下降不低于30%。

6.一种用于中国黄牛早期妊娠诊断方法，其特征在于，包含以下步骤：

7.根据权利要求6所述的一种用于中国黄牛早期妊娠诊断方法，其特征在于，所述步骤s102中差异蛋白的筛选方法如下：在鉴定到的蛋白质中，按照显著性p极低且差异倍数fc极大的标准筛选出符合条件的差异蛋白，所述显著性p极低为p＜0.05，所述差异倍数fc极大为fc＞1.2或fc＜0.833。

8.根据权利要求6所述的一种用于中国黄牛早期妊娠诊断方法，其特征在于，所述步骤s101中的指定天数和步骤s103中的指定天数相同，其中，步骤s101中的指定天数为母牛妊娠后第21天，步骤s103中的指定天数为母牛受精后第21天。

9.根据权利要求6所述的一种用于中国黄牛早期妊娠诊断方法，其特征在于，所述步骤s103中的判断方法为：当fgb蛋白在母牛受精后21天血清中的表达量相对于受精后0天时血清中的表达量上升不低于60%和/或c4bpa蛋白在母牛受精后21天血清中的表达量相对于受精后0天时血清中的表达量下降不低于30%时，诊断母牛此时已妊娠。

技术总结
本发明公开了用于中国黄牛早期妊娠诊断的蛋白标志物及其诊断方法，所述蛋白标志物包括如下蛋白中的一种或多种组合：FGB蛋白，其序列如氨基酸序列SEQ ID NO.1所示；C4BPA蛋白，其序列如氨基酸序列SEQ ID NO.2所示，其诊断方法，包含以下步骤：S101、血液样本采集；S102、血清测序；S103、妊娠诊断。本发明筛选出了显著性极低和差异倍数极大的两个蛋白即FGB和C4BPA作为中国黄牛早期妊娠血清蛋白标志物，解决了黄牛早期妊娠诊断的血清蛋白标志物研究缺乏的问题，可在黄牛受精后21天的血清中直接得到妊娠的诊断结果。

技术研发人员：杨易,杜长征,谢贤国,徐金瑞,马亚博,王兴平
受保护的技术使用者：宁夏大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17