植物体内检测去泛素化修饰类型的方法

本发明涉及植物体内去泛素化修饰的检测，具体为一种在本氏烟植物体内检测去泛素化修饰类型的方法。

背景技术：

1、泛素(ubquitin,ub)是一种高度保守的多肽，由76个氨基酸组成，可以通过多个过程共价连接到目标蛋白实现对目标蛋白的泛素化。蛋白质的泛素化修饰是一种典型的翻译后修饰，调控蛋白质的功能和命运。

2、蛋白质的泛素化修饰过程包括一系列的酶链反应：首先是通过泛素激活酶e1激活ub，将ub转移到e1上；然后是泛素结合酶e2将ub转移到e2；最后是泛素连接酶e3识别蛋白质底物并将ub从e2转移到底物上。ub与底物蛋白之间的连接依赖于其c端的甘氨酸(glycine,g)残基与底物的赖氨酸(lysines,k)残基形成的异肽键。

3、蛋白泛素化是一个动态可逆的过程，泛素分子能够被去泛素酶(deubiquitinating enzyme,dub)通过水解泛素羧基端的异肽键从泛素化底物上水解下来。根据氨基酸序列和结构的相似性，将dub分为6类，分别是泛素特异性蛋白酶、泛素c末端水解酶、卵巢肿瘤蛋白酶、machado-joseph疾病蛋白酶、jamm/mpn结构域相关的金属蛋白酶家族和单核细胞趋化蛋白诱导的蛋白。

4、泛素化可分为单泛素与多泛素化修饰，由于泛素分子存在7个k残基，多泛素化修饰又分为k6、k11、k27、k29、k33、k48、k63这7个不同的泛素化修饰类型。不同的泛素化修饰类型具有不同的功能，其中k48多聚泛素化主要参与蛋白酶体介导的泛素化降解途径，而k63多聚泛素化主要控制蛋白质的内吞作用及其运输和酶活等。明确泛素化和去泛素化修饰的类型，有助于蛋白功能解析以及去泛素化酶抑制剂的筛选与鉴定。然而目前，植物体内缺乏检测泛素化修饰类型的手段，通过质谱鉴定泛素化修饰位点无法明确泛素化修饰的类型，虽然可以通过体外水解泛素-7-氨基-4-甲基香豆素和双泛素等底物明确去泛素化酶的功能，但是却无法反映植物体内真实的泛素化修饰类型，并且体外手段无法检测特定蛋白的泛素化修饰情况。

技术实现思路

1、本发明针对以上不足之处，提供了一种在植物体内检测去泛素化修饰类型的方法，在植物体内建立检测泛素化和去泛素化修饰类型的技术体系，为研究植物泛素化修饰和去泛素化修饰提供技术保障。该发明不仅能够广谱性检测去泛素化修饰类型，侧面揭示植物体内泛素化修饰类型，同时，可对特定蛋白的泛素化修饰类型进行检测和鉴定。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：植物体内检测去泛素化修饰类型的方法，包含有如下步骤：

3、一、获得ub及其系列突变体

4、(1)将ub氨基酸中第6、11、27、29、33、48、63位编码赖氨酸全部替换为精氨酸，合成该基因，并将该基因克隆在puc57载体；

5、(2)将合成该基因的第6、11、27、29、33、48、63位精氨酸分别利用引物进行逐一回复突变为赖氨酸，获得7个突变体，然后将ub及突变体分别与myc标签融合，构建到植物双元表达载体pcambia1300，获得包括pcambia-ub:myc在内的8个不同的质粒；

6、二、去泛素化酶及其功能缺失突变体的构建

7、(1)所述去泛素化酶为水稻条纹病毒rna依赖的rna聚合酶n端的otu结构域，首先利用引物otu/f和otu/r扩增otu的序列，并连接到平末端载体plb上，即plb-otu；以此质粒为模板，利用引物otu/c45a/f和otu/c45a/r进行背向扩增突变第45位活性位点为丙氨酸，并将线性化的载体进行in-fusion，得到突变体，即plb-otuc45a；以plb-otuc45a为模板，利用引物otu/h148a/f和otu/h148a/r进行背向扩增突变第148位活性位点为丙氨酸，将线性化载体进行in-fusion，得到突变体plb-otucha；即无去泛素化修饰功能的蛋白。

8、(2)瞬时表达载体构建：对以上plb-otu和plb-otucha质粒进行sali和bamhi酶切，将回收的片段与经sali和bamhi酶切的pcambia-flag进行t4 dna连接，从而得到最终的瞬时表达质粒pcambia-otu:flag、pcambia-otucha:flag；三、确定类型

9、(1)将第一步和第二步得到的质粒分别电击转化农杆菌感受态eha105，涂布到含卡纳霉素和利福平抗性固体培养基平板上，并置于28℃培养48小时；

10、(2)挑取固体平板上农杆菌单菌落进行28℃振荡培养，然后收集过夜培养的菌液10ml；

11、(3)用5-10ml浸润buffer(10mm mes、0.01m mgcl2、0.2mm乙酰丁香酮)悬浮菌体并室温静置处理2小时，调整od600至0.7-0.8；

12、(4)将上一步处理得到的菌液利用注射器对生长20天左右的本氏烟叶片左右两边进行浸润接种；

13、去泛素化修饰功能检测组：叶片左边pcambia-otu:flag+pcambia-ub:myc；

14、叶片右边pcambia-otucha:flag+pcambia-ub:myc；

15、去泛素化修饰类型检测组：叶片左边pcambia-otu:flag+待检测位点ub突变体；叶片右边pcambia-otucha:flag+待检测位点ub突变体；

16、(5)在浸润48小时后取叶片左右两边各0.1g，提取植物总蛋白，并进行免疫杂交检测；

17、(6)根据免疫杂交弥散条带检测情况，进行判断，

18、ub与otu活性突变体共表达时，若检测到弥散条带明显，说明植物体内发生泛素化修饰，otu活性突变体无去泛素化修饰的功能；

19、ub与otu共表达时，若检测弥散条带不明显，说明植物体内的泛素化修饰被otu去除，otu发挥去泛素化修饰的功能；

20、待检测位点ub突变体与otu活性突变体共表达时，若检测到明显弥散条带，说明植物体内发生该位点的泛素化修饰；若检测不到明显弥散条带，说明植物体内不发生该位点的泛素化修饰或实验条件有限无法检测；

21、待检测位点ub突变体与otu共表达时，若未检测到明显弥散条带，即在此位点检测不到泛素化修饰，说明该位点被去泛素化修饰；若检测到与ub突变体和otu活性突变体共表达时一致的明显弥散条带，则说明该位点不被去泛素化修饰。

22、进一步的，所述ub赖氨酸全部突变为精氨酸的氨基酸序列如seq id no：1所示。

23、进一步的，所述第6、11、27、29、33、48、63位精氨酸回复突变为赖氨酸的氨基酸序列如下所示：r6k:seq id no：2；r11k:seq id no：3；r27k:seq id no：4；r29k:seq id no：5；r33k:seq id no：6；r48k:seq id no：7；r63k:seq id no：8。

24、进一步的，所述otu氨基酸序列如seq id no：9所示；所述plb-otucha氨基酸序列如seq id no：30所示。

25、进一步的，所述步骤一、(2)的引物为以下一种或几种：uk6/f的序列如seq id no：10所示；ubk6/r的序列如seq id no：11所示；ubk11/f的序列如seq id no：12所示；ubk11/r的序列如seq id no：13所示；ubk27/f的序列如seq id no：14所示；ubk27/r的序列如seqid no：15所示；ubk29/f的序列如seq id no：16所示；ubk29/r的序列如seq id no：17所示；ubk33/f的序列如seq id no：18所示；ubk33/r的序列如seq id no：19所示；ubk48/f的序列如seq id no：20所示；ubk48/r的序列如seq id no：21所示；ubk63/f的序列如seq id no：22所示；ubk63/r的序列如seq id no：23所示。

26、进一步的，所述步骤一、(2)所述的8个不同质粒分别为：pcambia-ub:myc、pcambia-ubr6k:myc、pcambia-ubr11k:myc、pcambia-ubr27k:myc、pcambia-ubr29k:myc、pcambia-ubr33k:myc、pcambia-ubr48k:myc、pcambia-ubr63k:myc。

27、进一步的，otu/f的序列如seq id no：24所示；

28、otu/r的序列如seq id no：25所示；

29、otu/c45a/f的序列如seq id no：26所示；

30、otu/c45a/r的序列如seq id no：27所示；

31、otu/h148a/f的序列如seq id no：28所示；

32、otu/h148a/r的序列如seq id no：29所示。

33、本发明的有益效果：

34、本发明通过突变ub的赖氨酸位点，获得针对第6、11、27、29、33、48、63位特异的泛素化修饰突变体，从而能够利用该体系检测植物体内的泛素化修饰类型，解决质谱无法检测泛素化修饰类型的问题；在与去泛素化酶otu共表达时，检测到了植物体内的去泛素化修饰，说明利用该体系可以有效检测植物体内的去泛素化修饰类型，弥补了体外检测手段的局限性；进一步，利用该发明的泛素突变体与特定泛素化蛋白共表达，也可以检测特定蛋白的泛素化修饰类型。总之，该发明利用去泛素化酶与泛素突变体共表达，建立了一套在植物体内检测去泛素化修饰类型的技术手段，同时在检测过程中反映了体内的泛素化修饰类型。