一种FRET校准参数测量数据的预处理方法与系统

本发明属于荧光共振能量转移(fret)检测的，具体涉及一种fret校准参数测量数据的预处理方法与系统。

背景技术：

1、荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，fret)是指两个荧光基团足够靠近时，处于激发态的供体荧光基团将能量以非辐射形式转给邻近受体荧光基团的过程。两个荧光基团间的fret作用强弱通常采用二者间的fret效率(e)来表征(zalt,gascoigne n r j.photobleaching-corrected fret efficiency imaging of livecells[j].biophysical journal,2004,6(6):3923-3939)。基于荧光蛋白(fluorescentproteins,fps)的fret显微术已广泛应用于研究活细胞中蛋白质间的相互作用。

2、fret双杂交技术可以得到fret效率、蛋白质相对亲和力大小和化学计量比，因此已成为研究的热点。fret双杂交技术需要计算以受体为中心的fret效率ea和以供体为中心的fret效率ed，其中ea可以通过33-fret等方法测量，ed可以通过e-fret等方法测量。

3、确定fret测量系统的校准参数是实现定量fret检测技术的前提。在诸多系统校正参数中，与仪器以及荧光分子的固有性能相关的系统校准参数尤其是系统敏化淬灭因子g和受体-供体消光系数之比尤为重要。

4、系统敏化淬灭因子g将受体敏化发射与发生fret导致的供体荧光的下降联系起来，是e-fret方法的关键参数，特别是对于求解e-fret效率至关重要。对于固定的成像系统与fret荧光团，g是一个常数。

5、受体-供体消光系数之比是33-fret方法的关键参数。消光系数也称摩尔吸光系数，是指光通过浓度为1摩尔/升溶液时，光程长度为1厘米时的吸光值，通常用ε表示。

6、根据被检测样本的质粒数量不同，测量系统敏化淬灭因子g的方法可大致分为2004年zal等提出的单质粒漂白法、2006年chen等人提出的双质粒法以及2016年butz等人提出的通过供体-受体比为1:1的多个固定质粒测量系统校准参数的双杂交多质粒方法(th-m)。

7、th-m方法具体指对于供体-受体比为1:1的标准fret样本，比如c4y、c10y、c40y、c80y等，在质粒都完全表达的情况下，根据测得的标准质粒的表观效率是真实效率e，于是有e＝ea＝ed，经重新排列可得

8、

9、该式中a、d为光谱串扰系数，iaa为受体激发光下受体通道探测的荧光强度，idd为供体激发光下供体通道探测的荧光强度，ida为供体激发光下受体通道探测的荧光强度。令-g＝m、可得到直线方程y＝m·x+b，显然斜率m的相反数就是系统敏化淬灭因子g，截距b的倒数就是受体-供体消光系数之比

10、因此在进行fret系统校准时，可以利用多个不同的供体-受体比为1:1的标准fret样本，比如c4y、c10y、c40y等。每种标准fret样本下，唯一数据点线性拟合各样本最后得到的平均数据点，从而获得直线方程的表达式，最终得到g与

11、在激发光场均匀、细胞均匀成熟情况下，fret双杂交技术多质粒方法拟合求校准参数方法可以同时求解出系统敏化淬灭因子g与受体-供体消光系数之比结果较为准确且计算简单、方便。但该方法受实验条件影响波动较大、不稳定，容易出现拟合错误或者拟合非线性的情况。例如，当激发光场不均匀时，x值波动性比较大，比较离散。另外，当供体激发光与受体激发光不能完全重合时，x值受所选取的roi位置影响较大，容易导致拟合结果线性程度不佳或拟合结果偏差较大。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种fret校准参数测量数据的预处理方法与系统。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明的一个方面，提供了一种fret校准参数测量数据的预处理方法，包括下述步骤：

4、测量光谱串扰系数a,b,c,d，并利用e-fret方法得到三通道灰度值强度iaa,idd,ida、受体敏化发射强度fc，计算供体发射串扰强度d·idd与受体激发串扰强度a·iaa之比xi和对应的受体敏化发射强度fc与受体激发串扰强度a·iaa之比yi，得到所有(xi,yi)数据，其中i＝1,2,…,n，n为数据点总个数；

5、对数据点进行评估，剔除过离散点；

6、根据xi值大小对数据点(xi,yi)进行排序，并等间隔区间划分数据点；

7、计算各区间内(xi,yi)的平均值后再对多个区间平均值求平均得到唯一数据点

8、对多种不同种类标准fret样本重复上述操作，将每种标准fret样本最后得到的平均数据点进行线性拟合求得fret测量系统校准参数。

9、作为优选的技术方案，光谱串扰系数通过单独表达供体蛋白和单独表达受体蛋白的两种细胞样本测量得到，并且进行e-fret校准参数测量的活细胞为供体-受体比为1:1的标准fret样本，所选取感兴趣区域的三个通道信噪比均大于3。

10、作为优选的技术方案，所述受体敏化发射强度fc通过下式求得：

11、fc＝ida-a·(iaa-c·idd)-d·(idd-b·iaa)。

12、作为优选的技术方案，所述将过离散点剔除具体为：

13、计算每个质粒对应的供体发射串扰强度与受体激发串扰强度之比xi的标准差σ；

14、若2σ小于1，则认为数据点良好，不进行剔除；

15、若2σ在[1,1.5]之间，则将平均值±2σ之外的点剔除；

16、若2σ大于1.5，则认为数据点异常，并进行过离散点的剔除，所述过离散点定义为前后间隔超过6倍区间间隔的点；剔除过离散点后若2σ仍大于1.5，则认为数据不能够采用，需重新圈点。

17、作为优选的技术方案，所述根据xi值大小对数据点(xi,yi)进行排序，并等间隔区间划分数据点，具体为：

18、将数据点按照xi值大小进行排序，排序后设置初始分组数不少于25组，根据xi的极差除以初始分组数并将结果保留至小数点后2位，得到区间间隔；然后将数据点进行等间隔划分。

19、作为优选的技术方案，所述根据xi值大小对数据点(xi,yi)进行排序，具体为按xi值的大小从小到大的顺序或按从大到小的顺序进行排序，并且yi值排序是依据对应的xi值进行的。

20、作为优选的技术方案，所述将数据点进行等间隔划分，得到的数据区间为前开后闭区间。

21、作为优选的技术方案，所述进行线性拟合求得fret测量系统校准参数，具体为：

22、线性拟合各标准fret样本最后得到的平均数据点，得到直线方程y＝m·x+b，其中斜率m的相反数即为系统敏化淬灭因子g，截距b的倒数即为受体-供体消光系数之比

23、本发明的另一个方面，还提供了一种fret校准参数测量数据的预处理系统，应用于上述的一种fret校准参数测量数据的预处理方法，包括参数获取模块、数据评估模块、区间划分模块、数据平均模块以及线性拟合模块；

24、所述参数获取模块用于测量光谱串扰系数a,b,c,d，并利用e-fret方法得到三通道灰度值强度iaa,idd,ida、受体敏化发射强度fc，计算供体发射串扰强度d·idd与受体激发串扰强度a·iaa之比xi和对应的受体敏化发射强度fc与受体激发串扰强度a·iaa之比yi，得到所有(xi,yi)数据，其中i＝1,2,…,n，n为数据点总个数；

25、所述数据评估模块用于对数据点进行评估，剔除过离散点；

26、所述区间划分模块用于根据xi值大小对数据点(xi,yi)进行排序，等间隔区间划分数据点；

27、所述数据平均模块用于计算各区间内(xi,yi)的平均值后再对各个区间平均值求平均得到唯一数据点

28、对多种不同种类标准fret样本重复上述操作，利用所述线性拟合模块将每种标准fret样本最后得到的平均数据点进行线性拟合求得fret测量系统校准参数。

29、本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

30、(1)利用本发明的方法可以降低大量偏差较大的数据对拟合结果的影响，从而极大地提高校准参数的稳定性和定量fret测量结果的可靠性。具体可体现在两个方面，第一，使用该方法后可以较好解决利用fret双杂交技术多质粒方法测量系统校准参数时拟合偏离线性的情况。第二，使用该方法后可以解决拟合结果较差的情况。