用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条及其制备方法与流程

本发明属于体外诊断生化检测，具体涉及用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术：

1、基于荧光免疫层析技术的抗体检测相比酶联免疫法等方法的自动化程度更高，应用前景更广。对于荧光免疫层析试纸条的检测性能的提高主要在于检测灵敏度和重复性的提高，进而提高检测结果准确度，降低漏检率。

2、另外，在临床中，通常需要结合多个相关抗体水平辅助疾病诊断。例如抗中性粒细胞胞浆抗体（anca）是指与中性粒细胞及单核细胞胞浆中溶酶体酶发生反应的抗体，是鉴别诊断血管炎的重要标记物，分胞浆型（c-anca）和核周型（p-anca）两种。髓过氧化物酶（mpo）是p-anca的主要靶抗原，蛋白酶3（pr3）是胞浆型anca（c-anca）的主要靶抗原，抗mpo抗体和抗pr3抗体临床上用于韦格纳肉芽肿（wg）等原发性系统性血管炎的辅助诊断。抗肾小球基底膜抗体（抗gbm抗体）同样作为血管炎鉴定诊断指标之一，在检测抗髓过氧化物酶抗体、抗蛋白酶3抗体的同时，联合检测抗肾小球基底膜抗体，满足同时检测血管炎三项指标可对anca相关小血管炎的诊断、治疗和预后判断有重要的临床意义。目前市面上还未见同时检测抗mpo抗体和抗pr3抗体的荧光免疫层析试纸条或同时检测抗mpo抗体、抗pr3抗体和抗gbm抗体的荧光免疫层析试纸条。

3、在自身免疫性疾病的实际诊断中，由于一种自身免疫性疾病可检测出多种自身抗体，因此临床往往需要参考多种免疫指标才能得出正确的诊断，联合检测可大幅减少因单项检测出现的漏诊问题，然而常规的单抗体检测试纸条一次只能检测一种抗体水平，而多指标检测则需要不同的检测试纸条，成本高，耗时长，样本所需量大。而多抗体荧光免疫层析试纸条，需要同时保证多个抗体的检测灵敏度、特异性和准确度，开发难度更高。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种检测灵敏度更高、重复性更好的用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条。

2、为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、一种用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条，包括底板和依次搭载在所述底板上的样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述结合垫上包被有荧光微球标记的抗人igg抗体和荧光微球标记的dnp-bsa，所述硝酸纤维素膜上设有抗体检测线和质控线，所述抗体检测线由包被在所述硝酸纤维素膜上的胶乳微球标记的抗原形成，所述胶乳微球的粒径为100nm~400nm。

4、优选地，所述胶乳微球的粒径为135nm~250nm，例如135nm、140nm、145nm、150nm、155nm、160nm、165nm、170nm、175nm、180nm、185nm、190nm、195nm、200nm、205nm、210nm、215nm、220nm、225nm、230nm、235nm、240nm、245nm、250nm。

5、进一步优选地，所述胶乳微球的粒径为150nm~230nm。

6、再进一步优选地，所述胶乳微球的粒径为160nm~220nm。

7、更进一步优选地，所述胶乳微球的粒径为180nm~200nm。

8、优选地，所述荧光微球为铕螯合荧光微球。

9、优选地，所述荧光微球的粒径为100nm~300nm，例如100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm。

10、进一步优选地，所述荧光微球的粒径为150nm~250nm。

11、更进一步优选地，所述荧光微球的粒径为180nm~220nm。

12、优选地，所述硝酸纤维素膜上设有多条互不干涉的抗体检测线，不同抗体检测线上包被的抗原不同。

13、进一步优选地，所述硝酸纤维素膜上设有2~4条互不干涉的抗体检测线，相邻两条抗体检测线之间的距离为4mm~5mm。

14、进一步优选地，所述胶乳微球标记的抗原选自胶乳微球标记的mpo抗原、胶乳微球标记的pr3抗原、胶乳微球标记的gbm抗原。

15、优选地，所述样本垫为包被有酪蛋白、吐温、海藻糖和异嗜性抗体阻断剂的玻璃纤维素膜。

16、优选地，所述结合垫采用玻璃纤维素膜，其上包被的荧光微球标记的抗人igg抗体和荧光微球标记的dnp-bsa的体积比为（8~20）:1，进一步优选为（10~15）:1，再进一步优选为（12~15）:1。

17、优选地，所述质控线由包被在所述硝酸纤维素膜上的dnp抗体形成。

18、本发明还提供上述用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条的制备方法，所述制备方法包括：

19、采用样本垫封闭液处理第一玻璃纤维膜制得样本垫；

20、将含有荧光微球标记的抗人igg抗体和荧光微球标记的dnp-bsa的喷金液喷涂到第二玻璃纤维素膜上，经烘干制得所述结合垫；

21、将胶乳微球标记的抗原包被在硝酸纤维素膜上形成检测线，将dnp抗体包被在硝酸纤维素膜上形成质控线；

22、将样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸以及底板组装得到所述用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条。

23、具体地，所述样本垫封闭液的配方为：0.1~0.5wt%酪蛋白、0.5~1.5wt%吐温、3~8wt%海藻糖、0.05~0.2mg/ml异嗜性抗体阻断剂，其余为ph值为8~9、浓度为40~60mm的tris缓冲液。

24、根据一些具体实施方式，采用样本垫封闭液浸润第一玻璃纤维膜，然后在30℃~60℃下烘干，制得所述样本垫。

25、根据一些具体实施方式，在所述喷金液中，所述荧光微球标记的抗人igg抗体的体积占比为30~50%，所述荧光微球标记的dnp-bsa的体积占比为1~5%。

26、根据一些具体实施方式，将所述喷金液喷涂到所述第二玻璃纤维膜上，在30℃~60℃下烘干，制得所述结合垫。

27、根据一些具体实施方式，使用含有2~8wt% 海藻糖和2~8wt% bsa的ph值为7.2~7.8的浓度为8~12mm的 pb缓冲液混合胶乳微球标记的抗原得到胶乳微球标记的抗原包被液，将所述胶乳微球标记的抗原包被液在所述硝酸纤维素膜上划线，在30℃~60℃下烘干，形成所述抗体检测线。

28、根据一些具体实施方式，使用含有2~8wt% 海藻糖的ph值为7.2~7.8的浓度为8~12mm的 pb缓冲液混合dnp抗体得到dnp抗体包被液，将所述dnp抗体包被液在所述硝酸纤维素膜上划线，在30℃~60℃下烘干，形成所述质控线。

29、根据一些具体实施方式，所述样本稀释液的配方为：0.15~0.25g/l磷酸二氢钠，1.0~1.5g/l磷酸氢二钠，5~10g/l氯化钠，0.3~0.8wt%防腐剂和0.3~0.8wt%吐温，其余为ph值为7.2~7.6、浓度为5~15mm的pbs缓冲液。

30、优选样本稀释液中防腐剂为proclin 300，吐温为吐温-20。

31、本发明还提供一种基于荧光免疫分析的抗体定量检测系统，所述抗体定量检测系统包括荧光免疫分析仪、上述荧光免疫层析试纸条和样本稀释液，所述荧光免疫层析试纸条上设有id卡，所述id卡中存储有标定数据和/或标准曲线。

32、本发明的抗体定量检测系统的检测方法包括以下步骤：

33、（1）将所述荧光免疫层析试纸条插入所述荧光免疫分析仪，读取所述id卡上的标定数据和/或标准曲线，读取完毕后拔下所述荧光免疫层析试纸条；

34、（2）可选择性地采用样本稀释液稀释待测样本，将未稀释或稀释后的待测样本滴加到所述荧光免疫层析试纸条上，静置反应5min~15min，未稀释或稀释后的待测样本依次经过所述样本垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜到达所述吸水纸上；

35、（3）将静置反应后的荧光免疫层析试纸条再次插入所述荧光免疫分析仪，读取所述抗体检测线和所述质控线的荧光强度，根据所述标定数据和/或标准曲线计算并输出待测样本的待测抗体浓度。

36、本发明与现有技术相比具有如下优势：

37、本发明的荧光免疫层析试纸条中硝酸纤维素膜上的检测线由胶乳微球标记的抗原形成，相比现有技术中抗原直接包被的形式，胶乳微球标记的抗原对待测抗体的特异性捕获效率更高，荧光强度更高，检测灵敏度更高，同时胶乳微球标记的抗原稳定性更好，检测重复性更好，检测结果更加准确。本发明的荧光免疫层析试纸条可以是单抗体检试纸条或多抗体联合检测试纸条，作为多抗体联合检测试纸条时，可以在保证每个待测抗体检测灵敏度、重复性和特异性的同时，降低样本所需量，实现快速检测。