检测甲胎蛋白异质体AFP-L3含量的试剂盒的制作方法

本发明涉及体外诊断，具体涉及检测甲胎蛋白异质体afp-l3含量的试剂盒。

背景技术：

1、原发性肝癌(hcc)发病隐匿，80％以上的肝癌患者确诊时已是中晚期，因此对肝癌高危人群进行早期筛查与监测至关重要。目前临床上hcc的早期筛查最常用的是血清标志物甲胎蛋白(afp)的检测，血清afp＞400ng/ml，在排除妊娠、慢性或活动性肝病、生殖腺胚胎源性肿瘤以及消化道肿瘤后，高度提示肝癌。但是afp检测hcc存在敏感性不足的问题，同时由于一些良性肝脏病变(包括慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化)、良性肝脏肿瘤、生殖系统肿瘤或者妊娠期，都可能会导致afp的升高，造成afp检测hcc特异性不足。

2、afp是一种糖蛋白，由于其不同糖基化形式可以分为三种异质体，根据其结合小扁豆凝集素(lca)的能力不同分为afp-l1、afp-l2和afp-l3。afp-l1主要来源于良性肝病细胞，呈现lca非结合性；afp-l2主要来自于卵黄囊肿瘤及妊娠期妇女，呈现lca弱结合性；afp-l3是因为其在afp的双触角型的糖链末端的n-乙酰葡萄糖胺上连有岩藻糖基，而该岩藻糖基化位点能够特异性被lca识别，因此呈现lca强结合性。分别测定样本中总afp浓度及其异质体afp-l3的浓度，计算afp-l3占总afp比率(afp-l3/afp)，以10％为cut-off确认结果，afp-l3％≥10％为阳性，afp-l3％＜10％为阴性。由于特征性核心岩藻糖基化会导致蛋白功能性改变，afp-l3通常来自肝癌细胞，因此afp-l3可以作为有效的肿瘤标志物进行肝癌的早期的检测。

3、《原发性肝癌诊疗指南(2022年版)》指出：血清afp是当前诊断肝癌和疗效监测常用且重要的指标，对于afp阴性的人群，需要借助异常凝血酶原(pivkaⅱ)、血浆游离微rna(microrna)、afp-l3和进行早期诊断可以有效提升肝癌诊断的敏感性和特异性。美国食品与药品监督管理局(fda)已于2005年批准将afp-l3的检测试剂和方法用于临床肝癌的预警。因此建立快速、敏感性高、特异性强的afp-l3检测方法十分必要。

4、目前国内临床检测afp-l3的方法全部基于lca的亲和吸附作用，afp-l3的亲和吸附离心管需要人工单样本操作，对样本进行稀释后过柱吸附，洗涤洗脱afp-l3后再通过afp检测试剂盒对处理前后样本进行定量；afp-l3检测试剂盒可以实现自动化操作，但是无论是亲和吸附离心管还是afp-l3检测试剂盒，对afp-l3全部是间接法，二者都需要对样本中的afp-l3进行提取后再进行afp定量。afp-l3的亲和吸附离心管操作繁琐，且人工操作误差难以避免，检测效率低。afp-l3检测试剂盒中也同样涉及afp-l3前处理的提取步骤，原样本经过afp-l3分离磁珠特异性吸附洗脱后得到afp-l3样本，原样本与afp-l3样本都需要采用afp检测磁珠进行afp的定量后计算afp-l3的占比。afp-l3检测试剂盒中afp-l3分离磁珠不同于常规直径约为1～3μm生物基团磁珠，为了获得最大载量需要采用直径为100μm左右的琼脂糖磁珠，这就导致了成本的增加，且lca的偶联效率难以保证，需要特殊制备，无形中增加了检测成本。现有的检测afp-l3的方法中都没有涉及样本变性的处理，而不经过十二烷基硫酸钠(sds)变性剂处理的样本，由于岩藻糖基化afp位点单一且微小，afp蛋白的二级结构很容易造成该位点的折叠或者相互覆盖，影响lca的识别，造成亲和吸附不完全，对afp-l3提取物反复提取后afp-l3的占比没有增加，这也是亲和吸附离心管及afp-l3检测试剂盒重复性差的根本原因。

5、日本wako的液相免疫亲和电泳则是采用直接法，在液相中双抗夹心捕捉总afp后，再利用lca对afp-l3的特异性吸附能力，对总afp中的afp-l3组分进行识别分离，该法可实现自动化直接对afp-l3定量，但是亲和电泳平台并不适合本项目检测技术的广泛应用。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了检测甲胎蛋白异质体afp-l3含量的试剂盒。

2、本发明提供了检测甲胎蛋白异质体afp-l3含量的试剂盒。本发明的试剂盒样本经过sds作为变性剂处理后，其中afp抗原的二级结构被打开，岩藻糖基化的afp(afp-l3)充分暴露，使之更容易识别并结合液相中的lca，形成afp-l3-lca复合物；同时我们首次在缓冲体系中引入ca2+和mn2+以及硫酸葡聚糖钠，两种金属离子以及硫酸葡聚糖钠盐对于维持lca活性有着重要作用。

3、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

4、本发明提供了试剂组合，包括样本处理剂和样品稀释液：

5、所述样本处理剂包括：0.06～1％(w/v)的sds和缓冲液b；

6、所述样品稀释液包括：1.25～40μg/ml的lca，0.6～10％(w/v)的硫酸葡聚糖钠和缓冲液b；

7、所述缓冲液b包括：0.15mol/l tris-nacl、1‰(w/v)proclin 300、1mmol/lcacl2、1mmol/l mncl2、1％(w/v)牛血清白蛋白和5‰(w/v)tritonx-100。

8、在本发明的一些具体实施方案中，所述样本处理剂包括：0.125～0.5％(w/v)sds和所述缓冲液b；

9、所述样品稀释液包括：5～20μg/ml lca，1～5％(w/v)硫酸葡聚糖钠和所述缓冲液b。

10、在本发明的一些具体实施方案中，所述样本处理剂包括：0.25％(w/v)的sds和所述缓冲液b；

11、所述样品稀释液包括：10μg/ml的lca，2.5％(w/v)的硫酸葡聚糖钠和所述缓冲液b。

12、在本发明的一些具体实施方案中，样品稀释液的制备方法包括：配制缓冲液b：0.15mol/l tris-nacl，ph8.0的缓冲液中依次加入1‰(w/v)proclin300、1mmol/l cacl2、1mmol/l mncl2、1％(w/v)牛血清白蛋白和5‰(w/v)tritonx-100，混匀后2～8℃保存待用。

13、称量lca 5mg溶解于1ml 0.15mol/l tris-nacl，ph8.0中，制备5mg/ml lca母液，缓冲液b稀释lca母液至5～20μg/ml后加入的硫酸葡聚糖钠为1.25～5％(w/v)，制得样品稀释液。

14、在本发明的一些具体实施方案中，样本处理剂的制备方法包括：称量0.1g sds溶解于1ml纯水中制备10％(w/v)sds母液，缓冲液b稀释sds母液至0.125％～0.5％(w/v)，制得所述样本处理剂。

15、在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂组合还包括磁微粒混悬液；

16、所述磁微粒混悬液包括活化的jsr羧基磁珠、lca单克隆抗体和封保液；

17、所述封保液包括：0.05mol/l tris-nacl缓冲液、1‰(w/v)proclin 300、1％(w/v)牛血清白蛋白、5％(w/v)蔗糖和0.5‰(w/v)tritonx-100。

18、在本发明的一些具体实施方案中，所述磁微粒混悬液中，活化jsr羧基磁珠的制备方法包括：取jsr羧基磁珠以pbs缓冲液清洗后，以25mg/mledc和25mg/mlnhs对磁珠活化1～1.5h，制得所述活化的jsr羧基磁珠。

19、在本发明的一些具体实施方案中，所述磁微粒混悬液的制备方法包括：以mes缓冲液洗涤所述活化的jsr羧基磁珠，再与2.5mg/ml lca单克隆抗体混合震荡3h，以乙醇胺终止反应0.5～1h，再以封保液封闭三次，制得磁微粒混悬液。

20、在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂组合还包括校准品；

21、所述校准品包括afp-l3抗原、0.05mol/l tris-nacl、1‰(w/v)proclin300和1％(w/v)牛血清白蛋白；

22、所述afp-l3抗原的浓度为0～1000ng/ml。

23、在本发明的一些具体实施方案中，所述afp-l3抗原的浓度为0ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml和1000ng/ml。

24、在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂组合还包括酶结合物反应液；

25、所述酶结合物反应液包括hrp标记的afp-l3单克隆抗体fab片段和缓冲液a；

26、所述缓冲液a包括：0.02mol/l pbs，1‰(w/v)proclin 300、1‰(w/v)酪蛋白、1％(w/v)牛血清白蛋白和5‰(w/v)tritonx-100。

27、在本发明的一些具体实施方案中，所述afp-l3单克隆抗体fab片段的制备方法包括：浓度为5mg/ml的afp-l3单克隆抗体在0.2mol/l的醋酸钠缓冲液(ph4.0)中4℃透析16h，然后按照加入afp-l3单克隆抗体：胃蛋白酶＝1:0.04(w/w)，37℃条件下水浴6h，加入3mol/l tris溶液调节ph至7.4；pbs中4℃透析16h；透析后流经pbs平衡过的seghadex g-100抗体纯化柱，收集流穿第一峰液体；加入终浓度10mmol/l的巯基乙醇后流经pbs平衡过的seghadex g-25，收集蛋白峰液体，紫外分光光度计检测蛋白含量2.7mg/ml，获得afp-l3单克隆抗体fab片段。

28、在本发明的一些具体实施方案中，所述酶结合物反应液的制备方法包括：取5.4mghrp，用纯化水配制成10mg/ml的浓度，加入与hrp溶液等体积的高碘酸钠(12.8mg/ml，纯化水溶解，现配现用)，4℃避光反应30min；加入与hrp溶液等体积的1％乙二醇溶液(现用现配)，4℃避光反应45min；加入2.7mg afp-l3单克隆抗体混合，用pd spintrap g-25离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先用pbs预处理脱盐柱，收集离心管中的混合液，按每mg抗体20μl的量加入硼氢化钠溶液(5mg/ml，纯化水溶解，现配现用)，4℃避光反应2h；缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃反应2h，离心(4℃，8000rpm，0.5h)，弃去上清；沉淀用适量pbs溶解，用pd spintrap g-25离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先用pbs预处理脱盐柱，收集离心管中的液体，制得所述hrp标记的afp单克隆抗体fab片段；

29、将所述hrp标记afp单克隆抗体fab片段按体积比1:1000加入到缓冲液a中，制得所述酶结合反应液；所述酶结合反应液的浓度为1.9μg/ml。

30、本发明还提供了所述试剂组合在制备检测肝癌的试剂盒中的应用。

31、在本发明的一些具体实施方案中，所述检测肝癌包括检测afp-l3。

32、在上述研究的基础上，本发明还提供了试剂盒，包括所述试剂组合以及可接受的辅料或助剂。

33、在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒检测afp-l3的方法包括：取离心(10000rmp，5min)后的血清样本，得上清；取所述上清25μl与等体积样本处理剂混合，37℃作用15min；加入含有lca的样品稀释液25μl以及磁微粒混悬液20μl于反应杯中，37℃温育反应15min，洗涤5遍；加入酶结合反应液50μl，37℃温育反应15min，洗涤5遍；加入发光底物，混匀后检测信号值。

34、本发明提供了检测甲胎蛋白异质体afp-l3含量的试剂盒。本发明的试剂盒通过lca单克隆抗体磁珠和hrp标记的afp-l3单克隆抗体fab片段对afp-l3-lca复合物进行双抗夹心，可直接定量样本中afp-l3的浓度，相对于间接提取afp-l3再定量的方法，避免了手动afp-l3分离提取再检测的过程，全程可以实现仪器自动化操作，误差小，准确度高。本发明的试剂盒对仪器和磁珠皆没有特殊要求，敏感性高、特异性强，成本低，可以单人检测可以批量操作。