一种基于茶叶制备金纳米粒子的生物分子检测方法

本发明属于生物分子检测方法，具体涉及一种基于茶叶制备金纳米粒子的生物分子检测方法。

背景技术：

1、当今社会，癌症、艾滋病和各种疾病严重威胁着人类的健康权和生命权。早期诊断和早期治疗是防治肿瘤与降低死亡率的最有效办法。因此肿瘤生物标志物的超灵敏检测成为癌症临床诊断和治疗的迫切要求。癌症、艾滋病等疾病的相关生物标记物在血液中的浓度达到低于飞克级（fg/ml）的水平，达到阿克级（ag/ml）的水平。因此，如何能够超灵敏地检测低浓度的生物分子对疾病的早期快速准确诊断和治疗起着至关重要的作用。

2、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, elisa)是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种检测抗体或抗原的一种敏感性很高的检测技术。

3、为了能够检测到更低浓度的生物分子，可以用增强elisa荧光产物的荧光信号强度方法来增加检测灵敏度。虞华康等（物理学报，2019，68：149101）和朱旭鹏等（物理学报，2019，68：147304）研究均证明了金纳米粒子的表面等离激元效应可以起到增强荧光强度的作用。jia, min等在food chemistry, 2021, 344: 128602中利用金纳米粒子的表面等离激元效应将bpa的检测灵敏度提高到6.20 pg/ ml，证明了金纳米粒子的表面等离激元效应在elisa中增强检测灵敏度的可行性。

4、但目前金纳米粒子elisa存在两个主要问题：（1）传统的金纳米粒子制备过程中会用到一些强腐蚀性化学试剂，如羟胺、硼氢化物，有机溶剂等，而且后期通常需要经过表面修饰来降低其生物学毒性，因此这些有毒试剂会造成环境污染严重，生产成本较高。（2）传统方法制备的金纳米粒子表面因缺少氨基、羧基等活性基团，将其应用到elisa中还需要进行生物化学表面修饰。

5、申请号为202211680144.7的专利通过叶绿体制备金纳米粒子，解决了化学修饰问题，提高了检测灵敏度。但这种方法存在两个问题：（1）叶绿体的提取较为繁琐，而且制备的金纳米粒子含有较多杂质，后期洗涤较为麻烦；（2）叶绿体制备的金纳米粒子的粒径变化较大，对检测灵敏度带来不利影响。

6、基于此，有必要发明一种绿色制备金纳米粒子的生物分子检测方法，以解决现有传统elisa生物分子检测方法灵敏度低的问题；现有金纳米粒子elisa生物分子检测方中传统方法制备的金纳米粒子表面因生物学毒性和缺少氨基、羧基等活性基团需要进一步生物化学表面修饰；以及因金纳米粒子含有较多杂质和粒径变化较大对检测灵敏度造成不利影响的问题。

技术实现思路

1、本发明为了解决现有金纳米粒子elisa生物分子检测方中传统方法制备的金纳米粒子表面因生物学毒性和缺少氨基、羧基等活性基团需要进一步生物化学表面修饰，和金纳米粒子杂质较多，粒径变化较大的问题，提供了一种基于茶叶制备金纳米粒子的生物分子检测方法。

2、本发明采用如下技术方案：

3、一种基于茶叶制备金纳米粒子的生物分子检测方法，包括如下步骤：

4、步骤s1：称取茶叶，用去离子水洗涤后放入试管中，加入去离子水，加热；

5、步骤s2：将加热得到的茶水过滤，收集滤液，将滤液注入离心管中；

6、步骤s3：将氯金酸溶液加入到离心管中，氯金酸与滤液中的茶多酚室温下反应；

7、步骤s4：利用离心机进行离心处理后，去除上清液，收集金纳米粒子；

8、步骤s5：加入去离子水对金纳米粒子进行洗涤，进行离心处理，去除上清液，这一洗涤过程反复1-3次，得到纯净的金纳米粒子；

9、步骤s6：洗涤完成后，向步骤s5中的金纳米粒子溶液中加入待检测生物分子对应的捕获抗体，对金纳米粒子和待检测生物分子对应的捕获抗体溶液充分搅拌反应；

10、步骤s7：利用离心机进行离心处理后，去除上清液，收集沉淀；

11、步骤s8：将洗涤液加入离心管中，搅拌，利用离心机进行离心处理后，去除上清液，洗涤掉未被金纳米粒子捕获的捕获抗体，收集沉淀；

12、步骤s9：向步骤s8中的沉淀中封闭液，进行孵化；

13、步骤s10：将洗涤液加入离心管中，搅拌洗涤，利用离心机进行离心处理后，去除上清液，收集沉淀；

14、步骤s11：向步骤s10中的沉淀中加入待检测生物分子，等待至捕获抗体和待检测生物分子充分反应；

15、步骤s12：利用离心机进行离心处理后，去除上清液，收集沉淀；

16、步骤s13：将洗涤液加入离心管中，搅拌，利用离心机进行离心处理后，去除上清液，洗涤掉未反应的待检测生物分子，收集沉淀；

17、步骤s14：向步骤s13中的沉淀中加入检测抗体，等待至待检测生物分子和检测抗体充分反应；

18、步骤s15：利用离心机进行离心处理后，去除上清液，收集沉淀；

19、步骤s16：将洗涤液加入离心管中，搅拌，利用离心机进行离心处理后，去除上清液，洗涤掉未反应的检测抗体，收集沉淀；

20、步骤s17：向步骤s16中的沉淀中加入标有酶的链霉亲和素，等待至检测抗体和链霉亲和素相交联；

21、步骤s18：利用离心机进行离心处理后，去除上清液，收集沉淀；

22、步骤s19：将洗涤液加入离心管中，搅拌，利用离心机进行离心处理后，去除上清液，洗涤掉未交联的链霉亲和素，收集沉淀；

23、步骤s20：向步骤s19中的沉淀中加入化学荧光底物，等待至酶化学荧光底物进行反应生成荧光产物；

24、步骤s21：加入终止液，检测溶液的吸光度以计算待测生物分子浓度。

25、进一步地，所述茶叶的加热方式为水浴加热，加热时间为10-20min

26、进一步地，氯金酸与滤液中的茶多酚反应的时间为5-15min。

27、进一步地，所述离心处理的转速为2000-5000rpm/min，离心处理的时间为10-30min。

28、进一步地，所述金纳米粒子和待检测生物分子对应的捕获抗体溶液充分搅拌反应的温度为37℃，充分搅拌反应的时间为10-30min。

29、进一步地，所述捕获抗体和待检测生物分子反应的温度为37℃，反应的时间为10-30min。

30、进一步地，所述待检测生物分子和检测抗体反应的温度37℃，反应的时间为10-30min。

31、进一步地，所述检测抗体和链霉亲和素相交联的温度为37℃，相交联的时间为10-30min。

32、进一步地，所述酶和化学荧光底物进行反应生成荧光产物的温度为37℃，时间为10-30min。

33、本发明的有益效果如下：

34、与现有传统elisa生物分子检测方法相比，本发明所述的一种基于茶叶制备金纳米粒子的生物分子检测方法，具有以下优点：一、金纳米粒子具有更大的比表面积，能够吸附更多的生物分子，从而提高检测灵敏度；二、金纳米粒子能够在液体中自由运动，能够吸附更多的生物分子，从而提高检测灵敏度；三、金纳米粒子可以利用自身的表面等离激元效应增强荧光产物的荧光强度，进而提高检测灵敏度。

35、与现有金纳米粒子elisa生物分子检测方法相比，本发明所述的一种基于茶叶制备金纳米粒子的生物分子检测方法，具有以下优点：一、利用茶叶制备金纳米粒子避免了传统的金纳米粒子制备过程中会用到一些强腐蚀性化学试剂，从而避免了金纳米粒子表面生物学毒性和制备过程造成的环境污染；二、利用茶叶制备金纳米粒子的表面具有氨基、羧基等活性基团，可以直接应用到elisa检测中，避免了生物化学表面修饰。

36、与现有叶绿体制备金纳米粒子相比，本发明所述的一种基于茶叶制备金纳米粒子的生物分子检测方法，具有以下优点：一、利用茶叶制备金纳米粒子避免了叶绿体制备过程中杂质较多问题，从而保证了金纳米粒子纯洁度；二、利用茶叶制备金纳米粒子避免了叶绿体制备过程中其他细胞器的影响，从而保证了金纳米粒子粒径的均一性。

37、本发明有效解决了解决现有传统elisa生物分子检测方法灵敏度低的问题；现有金纳米粒子elisa生物分子检测方中传统方法制备的金纳米粒子表面因生物学毒性和缺少氨基、羧基等活性基团需要进一步生物化学表面修饰；叶绿体制备的金纳米粒子杂质较多，粒径变化较大等问题。