一种定量检测人血浆中诺西那生的液相质谱联用方法

本发明涉及一种液相色谱串联质谱定量检测人血浆中诺西那生浓度的方法，属于药物分析。

背景技术：

1、诺西那生（nusinersen）为首个用于治疗罕见的脊髓性肌萎缩症（spinalmuscular atrophy，sma）的反义寡核苷酸类药物，于2016年获美国食品和药品管理局（foodand drug administration，fda）批准，2019年在我国获批上市。诺西那生是通过鞘内注射的，可以绕过血脑屏障到达中枢神经系统。目前，该药在我国人群中的药代动力学（pk）和药效学（pd）特点尚不明确，因此，在中枢神经系统和循环系统以及关键器官组织中对其定量生物分析是至关重要的。

2、反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，aso）通常指由15~25个核苷酸组成，并且进行了某些化学修饰的短链核酸。目前，aso类药物的分析方法类型大致分为二类：

3、第一类色谱分析方法，包括

4、1、高效液相色谱紫外/荧光法（high-performance liquid chromatography-uv

5、/fluorescence，hplc-uv/fd）；

6、2、毛细管凝胶电泳-紫外法（capillary gel electrophoresis-uv，cge-uv）；

7、3、液相色谱-质谱联用（liquid chromatography tandem mass spectrometry，lc-ms/ms）和液相色谱-高分辨率高质量精度质谱（liquid chromatography-highresolution accurate mass，lc-hram）；

8、第二类基于杂交的分析方法，包括

9、1、基于杂交的酶联免疫吸附测定（hybridized enzyme linked immunosorbentassay，helisa）和杂交-流式细胞术（hybridized flow cytometry，hfcm）；

10、2、基于杂交的hplc-fd方法；

11、基于杂交的分析方法尤其是helisa，因具有灵敏度高、样品前处理简单和通量高等特点，是临床前和临床研究中常用的分析方法。然而，在helisa方法中也存在几个不可避免的局限性，包括与其代谢产物（如n-1、n-2等）的交叉反应性、狭窄的动态范围、较差的组织样品相容性及样品中抗药物抗体存在的可能影响，更重要的是该方法开发的周期较长且成本高。在诺西那生的临床前和临床研究中，采用的正是helisa的方法[1]。相比之下，色谱分析方法，特别是lc-ms/ms技术将高分离能力的液相色谱法与高灵敏度和选择性的质谱法结合起来，除了可以对在生物样品中的寡核苷酸进行准确的定量分析，其还具有特异性强、定量范围宽及可同时测定多种分析物(如寡核苷酸药物及其代谢物)的优势[2]，此外，该方法不需要特殊试剂的设计和合成，方法更容易开发、开发周期短、实用性更强。

12、《results from a phase 1 study of nusinersen (isis-smn(rx)) inchildren with spinal muscular atrophy.》[3]报道了：诺西那生原研厂家进行药代动力学研究测定诺西那生浓度采用的是helisa方法或电化学发光法（electrochemiluminescence，ecl），helisa方法存在的问题如上；ecl虽然更加灵敏，检测范围更宽，存在的问题是该方法可能也受诺西那生的代谢产物发生的交叉反应及抗药物抗体存在等影响，影响诺西那生含量测定[4]，此外该方法需要合成特殊的碱基序列及试剂，开发周期长。

13、申请号201910432682.6的中国专利《检测猕猴血浆中中期因子反义寡核苷酸含量的方法》[5]公开了：取含有中期因子反义寡核苷酸的待测猕猴血浆，向所述猕猴血浆中加入流感泰德作为内标液，再加入适量氨水溶液、苯酚/二氯甲烷混合液，然后依次进行涡流后离心，以便得到处理后血样；取所述血样的上清液并进行lc/ms/ms分析；绘制标准曲线，并根据标准曲线法对所述待测猕猴血浆中所述中期因子反义寡核苷酸的含量进行定量分析，猕猴血浆中中期因子反义寡核苷酸的最低定量0.18μg/ml，该专利虽然公开了采用hplc-ms/ms检测猕猴血浆中中期因子反义寡核苷酸含量的方法，但诺西那生与中期因子反义寡核苷酸肽段结构不同，分子量不同，所以该方法未毕适用于人血浆中诺西那生的检测，更关键的是该方法的最低定量限相对较高，《results from a phase 1 study of nusinersen(isis-smn(rx)) in children with spinal muscular atrophy.》[3]和《treatment ofinfantile-onset spinal muscular atrophy with nusinersen: a phase 2, open-label, dose-escalation study》[6]报道：临床试验中，诺西那生在给药数小时内血药浓度可达到峰值，在接下来的24小时内血药浓度快速下降，此后7天内血药浓度下降速度明显减慢，其中在12mg组中，给予诺西那生后24h内血浆中药物浓度最低值显著低于0.18μg/ml（参见文献[6]正文中第6页），而且美国fda官网诺西那生注射液的药品说明书（12.3药代动力学）[7]显示：将诺西那生鞘内注射到脑脊液(csf)中，可使诺西那生从脑脊液分布到目标中枢神经系统(cns)组织。鞘内给药后，与脑脊液谷浓度相比，诺西那生的血浆谷浓度相对较低，脑脊液中（诺西那生）的平均终末消除半衰期估计为135至177天，血浆中的平均终末消除半衰期为63至87天。说明诺西那生在血浆中谷浓度低于脑脊液谷浓度，而人体药代动力学还要考察平均终末消除半衰期，所以该方法的定量限0.18μg/ml较高，不适合用于定量检测人血浆中诺西那生的含量，不适用于中国人群诺西那生的药代动力学研究。

14、申请号202180016257.4的专利《液相色谱法和质谱法用于表征寡核苷酸的用途》[8]公开了：本公开提供了已使用本文所述的液相色谱法和质谱法方法进行表征的所关注寡核苷酸以及包括所关注寡核苷酸的群体的组合物，在一些实施例中，所关注寡核苷酸为治疗性寡核苷酸，本公开提供了包括所关注寡核苷酸的药物组合物，其中组合物中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的寡核苷酸为所述所关注寡核苷酸。这个专利是用于表征分析的，定性地鉴定寡核苷酸的序列或者修饰等信息，这个方法只能检测成分单一的溶液中的寡核苷酸，不能从复杂的人血浆样品中提取富集和检测寡核苷酸。

15、《hybridization lc-ms/ms:an alternative bioanalytical method for anti-sense oligonucleotide quantitation in plasma and tissue samples》[9]报道了：需要对血浆和组织样本进行定量生物分析，以研究反义寡核苷酸的药代动力学和药效学特性。为了克服传统配体结合分析（lba）和lc-ms/ms方法在特异性、灵敏度和通量方面的固有缺陷，将寡核苷酸杂交和lc-ms/ms技术相结合，开发了一种替代性生物分析方法。通过与链亲和素磁珠偶联的生物素化有义链寡核苷酸杂交，从生物样品中提取靶aso。使用离子配对色谱法和串联质谱法（ms/ms），该方法在使用多种aso的测试中表现出高灵敏度（使用100µl血浆时为0.5ng/ml）、高特异性、宽线性范围、完全自动化和通用应用引入三元泵系统首次克服了传统离子配对lc-ms/ms中灵敏度下降的典型挑战。由于特异性高，使用血浆中的校准标准实现了各种生物基质的定量，大大提高了效率和一致性。另一个主要优点是能够同时定量aso代谢物。杂交lc-ms/ms被认为是血浆和组织样品中asos和代谢物定量的一种改进的替代方法，显示出取代传统lba和lc-ms/ms方法的巨大潜力，该方法是基于杂交的hplc-fd方法，其中分析物的结构、修饰和分子量与诺西那生均有区别，存在的问题是如果采用该方法检测血浆中诺西那生，需要为诺西那生设计碱基配对的试剂，需要较大的工作量去优化最佳长度和最佳序列的配对试剂，同时成本较高，且操作步骤复杂。

16、申请号202211619155 .4的中国专利《一种寡核苷酸类化合物浓度液相质谱联用检测方法》[10]公开了：本发明公开了一种寡核苷酸化合物浓度的液相质谱联用检测方法，以满足于寡核苷酸类化合物的半定量和定量的生物样本分析检测；液相部分的流动相使用六氟异丙醇和叔胺类缓冲盐体系以满足大部分的寡核苷酸的检测工作，从而通过引入离子对溶剂成分解决传统流动相无法做到寡核苷酸类化合物在色谱柱无法保留的问题，同时利用质谱进行筛选式采集方式解决了其他传统方法干扰大的问题，很好的提高了寡核苷酸类化合物液相方法的稳定性以及灵敏度，并通过计算机辅助有效解决了液相质谱方法对寡核苷酸这类带多电荷的化合物的质谱离子对和离子源条件优化的问题。该专利中分析物的结构、修饰和分子量与诺西那生均有区别，不同结构、修饰，分析方法不同，不一定适合人血浆中诺西那生的检测，而且该方法标准曲线检测样本最低浓度为47.5ng/ml，所以该专利的方法定量限较高，不适合于检测人血浆中诺西那生的含量。

17、《development of the method for nusinersen and its metabolitesidentification in the serum samples of children treated with spinraza forspinal muscular atrophy》[11]报道了一种诺西那生代谢物图谱鉴定的方法，在样品处理中，采用在液-液萃取（lle）基础上，再使用固相萃取（spe）的进行额外纯化效果最佳，然后应用高分辨质谱q-tof-ms对诺西那生代谢物图谱进行鉴定，该研究属于定性研究，非定量研究。

18、《improvement of serum sample preparation and chromatographic analysisof nusinersen used for the treatment of spinal muscular atrophy》[12]报道了一种将诺西那生代谢物从血清基质中萃取出来的方法优化及色谱分析方法的优化，以及代谢物的鉴定，样本处理采用液-液萃取（lle）；分散固相萃取（dspe）；基于杂交的提取的样本处理方法，分析方法包括uhplc-uv、uhplc-q-tof-ms，该方法属于定性研究，非定量研究。

19、反义寡核苷酸类药物的lc-ms/ms研究方法和技术所面临的最大挑战是如何高效地从生物基质中萃取、富集和识别药物和避免内源性物质干扰[13]，目前还没有一种准确度高、特异性强、灵敏度高、方法相对简单的专门用于检测人血浆中诺西那生的lc-ms/ms定量分析方法，以适用于进一步研究诺西那生在我国人群中的药代动力学（pk）和药效学（pd）特点。

20、参考文献：

21、[1]r.s. finkel, c.a. chiriboga, j. vajsar, et al., treatment ofinfantile-onset spinal muscular atrophy with nusinersen: a phase 2, open-label, dose-escalation study, lancet. 388 (2016) 3017-3026.

22、[2]a. liu, m. cheng, y. zhou, et al., bioanalysis of oligonucleotideby lc-ms: effects of ion pairing regents and recent advances in ion-pairing-free analytical strategies, int. j. mol. sci. 23 (2022)

23、[3]chiriboga ca, swoboda kj, darras bt, iannaccone st, montes j, devivo dc, norris da, bennett cf, bishop km. results from a phase 1 study ofnusinersen (isis-smn(rx)) in children with spinal muscular atrophy.neurology. 2016 mar 8;86(10):890-7. doi: 10.1212/wnl.0000000000002445. epub2016 feb 10. pmid: 26865511; pmcid: pmc4782111.

24、[4]norris da, post n, yu rz, greenlee s, wang y. bioanalysisconsiderations on the pharmacokinetic evaluation of antisense therapeutics.bioanalysis. 2019 nov;11(21):1909-1912. doi: 10.4155/bio-2019-0194. epub 2019oct 25. pmid: 31648523.

25、[5]车津晶,原梅,朱小雨,等.检测猕猴血浆中中期因子反义寡核苷酸含量的方法:201910432682[p][2023-10-07].

26、[6]finkel rs, chiriboga ca, vajsar j, day jw, montes j, de vivo dc,yamashita m, rigo f, hung g, schneider e, norris da, xia s, bennett cf,bishop km. treatment of infantile-onset spinal muscular atrophy withnusinersen: a phase 2, open-label, dose-escalation study. lancet. 2016 dec17;388(10063):3017-3026. doi: 10.1016/s0140-6736(16)31408-8. epub 2016 dec 7.pmid: 27939059.

27、[7]美国fda官网诺西那生注射液药品说明书

28、https://www.drugfuture.com/fda-ndc/label.aspx

29、[8]黄名,邱海波,徐晓滨,等.液相色谱法和质谱法用于表征寡核苷酸的用途.cn202180016257.4[2023-10-07].

30、[9]li,p.,gong,y.,kim,j.,liu,x.,&rooney,m..(2020).hybridization lc-ms/ms:an alternative bioanalytical method for anti-sense oligonucleotidequantitation in plasma and tissue samples. analytical chemistry, 2020 aug 4;92(15):10548-10559.

31、[10]权腾飞.一种寡核苷酸类化合物浓度液相质谱联用检测方法:202211619155[p][2023-10-30].

32、[11]buszewski b .development of the method for nusinersen and itsmetabolites identification in the serum samples of children treated withspinraza for spinal muscular atrophy[j].international journal of molecularsciences, 2022, 23.doi:10.3390/ijms231710166.

33、[12]studzińska s, szymarek j, mazurkiewicz-bełdzińska m. improvementof serum sample preparation and chromatographic analysis of nusinersen usedfor the treatment of spinal muscular atrophy. talanta. 2023 sep 6;267:125173.doi: 10.1016/j.talanta.2023.125173. epub ahead of print. pmid: 37690419.

34、[13]xu y, garofolo f, musuku a. the exciting world ofoligonucleotides: a multidisciplinary complex challenge for multitaskingingenious bioanalysts. bioanalysis. 2019 nov;11(21):1905-1908. doi: 10.4155/bio-2019-0264. pmid: 31829052.

技术实现思路

1、发明所要解决的问题：

2、为解决现有技术存在的问题，本发明研究建立了一种hplc-ms/ms定量检测人血浆中诺西那生浓度的方法，该方法具有专属性高，并且准确度、精密度、回收率、稀释稳定性及样品冻融稳定性等参数均符合检测要求，适合用作诺西那生的药代动力学研究。

3、为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

4、一、检测方法及步骤

5、1、配制标准曲线工作溶液：

6、（1）配制标准曲线工作溶液储备液

7、精密称取诺西那生，置于低吸附塑料瓶中，加入适量90%二甲基亚砜溶液，制成1.00mg/ml的诺西那生标准曲线工作溶液储备液，放置于-10~-30℃冰箱中保存备用；

8、（2）配制标准曲线工作溶液

9、在低吸附塑料瓶中配制诺西那生的标准曲线工作溶液，取诺西那生标准曲线工作溶液储备液加甲醇-血浆-水溶液（10：0.5：90，v/v/v）稀释配制成浓度为100，200，400，1000，4000，8000，16000，20000ng/ml的标准曲线工作溶液。

10、2、配制内标工作溶液：

11、（1）配制内标工作溶液储备液

12、取格列吡嗪加入适量90%二甲基亚砜溶液，配制成格列吡嗪浓度为1.00mg/ml的内标工作溶液储备液，放置于-10~-30℃冰箱中保存备用；

13、（2）配制内标工作溶液

14、取内标工作溶液储备液用甲醇-水溶液（5:95，v/v）稀释配制成格列吡嗪浓度为500ng/ml的内标工作溶液；

15、3、配制人血浆标准曲线样品：

16、在湿冰条件下使用人血浆与步骤（1）中标准曲线工作溶液以适当比例混合配制人血浆标准曲线样品，人血浆标准曲线样品中诺西那生的浓度分别是5.00、10.0、20.0、50.0、200、400、800、1000ng/ml；

17、4、待测人血浆样品及人血浆标准曲线样品的处理：

18、分别取待测人血浆样品及步骤3中配制的人血浆标准曲线样品各100µl，在湿冰条件下，分别加入100µl 0.3%三乙胺的乙腈溶液，然后分别在2500rpm条件下振荡5min后，在4℃ 3500g条件下离心5min，分别取上清液100µl，40℃氮气吹干，然后分别加入100μl所述内标工作溶液进行复溶，分别在800rpm条件下振荡5min后，4℃下3500g离心1min，分别取上清液，即为处理后样品。

19、5、处理后样品分别进行lc-ms/ms分析：

20、色谱条件如下：

21、色谱柱：waters xbridge c18，130å，3.5μm，4.6*50mm；

22、流动相a：含0.5%三乙胺和0.5%六氟异丙醇的水溶液；

23、流动相b：含0.5%三乙胺和0.5%六氟异丙醇的乙腈溶液；

24、强洗针液：0.1%三乙胺溶在甲醇-乙腈-异丙醇-水混合溶液中，所述甲醇-乙腈-异丙醇-水混合溶液为体积比为1：1：1：1的甲醇、乙腈、异丙醇和水配制；

25、弱洗针液：10%甲醇水溶液，所述10%甲醇水溶液为体积比10：90的甲醇和水配制；

26、流速：0.800ml/min；

27、进样量：10μl；

28、洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：

29、0～0.01min，a相为95%，b相为5％；

30、0.01～2.00min，a相从95%降为65%，b相从5％升到35%；

31、2.00～3.00min，a相从65%降为5%，b相从35％升到95%；

32、3.00～3.80min，a相为5%，b相为95%；

33、3.80～3.85min，a相从5%升到95%，b相从95％降为5%；

34、3.85～4.20min，a相为95%，b相为5％；

35、4.20～4.25min，a相从95%降为5%，b相从5％升到95%；

36、4.25～4.60min，a相为5%，b相为95%；

37、4.60～4.65min，a相从5%升到95%，b相从95％降为5%；

38、4.65～5.00min，a相为95%，b相为5％；

39、5.00～5.05min，a相从95%降为5%，b相从5％升到95%；

40、5.05～5.25min，a相为5%，b相为95%；

41、5.25～5.30min，a相从5%升到95%，b相从95％降为5%；

42、质谱条件如下：

43、以高纯氮气作为气帘气、碰撞气，esi源负离子扫描，多离子反应监测扫描方式；

44、质谱参数：

45、碰撞气：high；气帘气：55psi；离子源气体1：50psi；离子源气体2：50psi；离子喷雾电压：-4500v；温度：550℃；质谱采集时长：6.00min；

46、lc-ms/ms分析过程中检测物参数：

47、诺西那生的监测离子对为m/z890.300→m/z393.400；格列吡嗪的监测离子对为m/z444.400→m/z170.200。

48、6、绘制标准曲线，并根据标准曲线法对待测人血浆样品中诺西那生的含量进行定量分析：

49、以人血浆标准曲线样品中的诺西那生与格列吡嗪的色谱峰峰面积比为纵坐标，以人血浆标准曲线样品的浓度为横坐标，进行线性回归，得到标准曲线；将待测人血浆样品中诺西那生与格列吡嗪的色谱峰峰面积比，代入标准曲线中计算，即得待测人血浆样品中诺西那生的含量。

50、二、质控样品制备：

51、1、配制质控样品工作溶液：

52、在低吸附塑料瓶中配制质控样品工作溶液，取诺西那生标准曲线工作溶液储备液，加甲醇-血浆-水溶液（10：0.5：90，v/v/v）稀释配制成浓度为100，300，3000，6000，15000ng/ml的质控样品工作溶液；

53、2、配制质控样品

54、在湿冰条件下使用人血浆与质控样品工作溶液混合，分别配制成诺西那生浓度是5.00、15.0、150、300、750ng/ml的质控样品。

55、三、对上述检测方法进行方法学验证

56、1、专属性

57、取正常人空白血浆、诺西那生血浆（lloq，浓度为5.00ng/ml）和格列比嗪血浆（浓度为500ng/ml），分别按“一、检测方法及步骤中4、和5”项下方法操作。

58、专属性结果表明：采用本技术的方法，血浆中内源性物质不干扰诺西那生及内标的测定。

59、2、线性范围及最低定量限

60、取已制备的人血浆标准曲线样本，分别按“一、检测方法及步骤中4、5和6”项下方法操作，建立工作曲线，曲线用watson limstm 7.5 sp1 (thermo scientific inc.)定量分析并采用linear，weighting factor=1/x2模型进行线性拟合。

61、线性范围结果：本技术的检测方法的线性范围为5.00-1000ng/ml，最低定量限为5.00ng/ml。

62、3、准确度和精密度

63、分别取“二、质控样品制备”制备的质控样品，质控样品的浓度分别是5.00、15.0、150、300、750ng/ml，每个浓度取6个样本按“一、检测方法及步骤中4、5和6”项下方法操作，连续测定3天，根据当日标准品工作曲线，分别计算质控样品的测得浓度，与配制浓度对照，求得测定方法的准确度与精密度。

64、准确度和精密度结果：本技术的检测方法批内准确度和精密度偏差和变异系数分别为-9.3%～10.9%，1.8%～14.6%之间；批间准确度和精密度偏差和变异系数分别为-7.3%～8.5%，3.4%～9.3%之间；说明本技术的方法批内和批间的准确度和精密度均符合规定。

65、4、回收率

66、分别取“二、质控样品制备”制备的质控样品，质控样品的浓度分别是5.00、15.0、150、300、750ng/ml，每个浓度取6个样本按“一、检测方法及步骤中4、5和6”项下方法操作，记录诺西那生及内标的峰面积，计算回收率。

67、回收率结果：平均回收率88.8%～96.6%之间，变异系数2.7%～4.4%之间，均符合规定，说明本技术的方法准确度符合规定。

68、5、基质效应

69、按“二、质控样品制备”项下方法分别配制6批来自不同个体血浆的质控样品、溶血血浆质控样品及高脂血浆质控样品，血浆质控样品、溶血血浆质控样品及高脂血浆质控样品浓度分别为15.0和750ng/ml，每个浓度各3份。按“一中4、5和6”项下方法操作，记录诺西那生及内标的峰面积，计算其基质因子。

70、基质效应结果：在低浓度的血浆质控样本中基质效应在86.0-95.3%之间，高浓度的血浆质控样本中基质效应在99.5-108.1%之间，符合规定，表明本技术的方法中血浆基质不影响诺西那生的浓度测定。

71、在低浓度的溶血血浆质控样本中基质效应为88.7%，在高浓度的溶血血浆质控样本中基质效应为112.5%，在低浓度的高脂血浆质控样本中基质效应为91.3%，在高浓度的高脂血浆质控样本中基质效应为105.9%，均符合规定，表明本技术的方法中溶血血浆及高脂血浆均不影响诺西那生的含量测定。

72、6、样本稳定性

73、按“二、质控样品制备”制备质控样品，质控样品的浓度分别是5.00、750ng/ml，考察质控样品的短期稳定性（湿冰，8h）、冻融稳定性（-20℃，5次冻融循环）、冻融稳定性（-80℃，5次冻融循环）、长期稳定性（-20℃，28天）、长期稳定性（-80℃，28天）、自动进样器中样本稳定性（待测样品，4℃，143h）

74、质控样品稳定性结果：诺西那生血浆样本在湿冰条件下可以稳定放置8h，在-20℃或-80℃至室温的冻融循环5次后保持稳定，且在-20℃或-80℃条件下可稳定保存至少28天，此外处理后的样品在自动进样器中（4℃）放置143h后保持稳定。

75、在湿冰条件下使用人全血与质控样品工作溶液混合，配制成诺西那生浓度分别是5.00、750ng/ml的全血质控样品，考察全血质控样品的稳定。

76、全血质控样品稳定性结果：全血质控样品在湿冰下2h内稳定。

77、7、稀释可靠性

78、稀释可靠性结果表明：本技术的检测方法稀释样品不影响诺西那生浓度的测定。

79、与现有技术相比，本技术的有益效果在于：

80、本发明采用lc-ms/ms方法定量检测人血浆中诺西那生的浓度，测定简单、快捷、结果准确，该方法适合应用于诺西那生的药代动力学研究。

81、1、本技术的方法采用液相色谱-质谱/质谱(lc-ms/ms)法具有很高的选择性，可以有效降低背景干扰，对复杂的血浆样品仍然可以达到很高的灵敏度，具有分辨率高、定量范围宽、扫描快等优点；本技术的方法能够有效提高检测灵敏度，最低定量限可达到5.00ng/ml，分析时间短，所需要的样品量少；

82、2、本技术的方法能够避免传统的helisa方法的缺陷，如与诺西那生代谢产物（如n-1、n-2等）的交叉反应性、狭窄的动态范围、较差的组织样品相容性及样品中抗药物抗体存在的可能影响，更重要的是helisa方法开发的周期较长且成本高；本技术能够避免ecl方法可能受诺西那生的代谢产物发生的交叉反应及抗药物抗体存在等影响，影响诺西那生药物测定，此外ecl方法需要合成特殊的碱基序列及试剂，开发周期长。

83、3、本技术的方法与基于杂交的hplc-fd方法相比，方法相对更简单。